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DROSOPHILA - PowerPoint PPT Presentation


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DROSOPHILA . Ciclo vitale . La drosophila ha un ciclo vitale rapido. 3mm. 0,5mm. 4d. 1d. Fecondazione/embriogenesi. 3d. 1d. 1d. 1 coppia di moscerini genera CENTINAIA di individui in 14dd. La progenie diventa matura sessualmente in 1 settimana.

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Presentation Transcript
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Ciclo vitale

La drosophila ha

un ciclo vitale

rapido

3mm

0,5mm

4d

1d

Fecondazione/embriogenesi

3d

1d

1d

1 coppia di moscerini genera CENTINAIA di individui in 14dd.

La progenie diventa matura sessualmente in 1 settimana.

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La Drosophila è un ottimo sistema modello:

  • Ha un ciclovitalerapido e produttivo
  • Animale piccolo, facile dasfamare e dacrescere (moltiindividui in pocospazio)
  • “Piccolo genoma”: 105 Mb (5% genomaumano
  • 4 cromosomi (2 autosomi + X + piccolo)
  • 14.000 geni
  • 100 annidigenetica
  • 75% geniumaniidentificati in Drosophila
  • MA……..
  • 1) I ceppi non possono essere congelati. Richiesta di
  • coltura continua.
  • 2) Non è possibile effettuare RICOMBINAZIONE OMOLOGA (no gene targeting)
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METODI PER CREARE DROSOPHILA MUTANTE (TRANSGENICA)

RAGGI IONIZZANTI (raggi X):

• SI: produzione di rotture cromosomiche visibili. Facile identificazione del gene

• NO: mutagenesi complesse in porzioni limitate di tessuto 1/1000

MUTAGENESI CHIMICA (EMS etc.)

• SI: mutagenesi di singole basi del genoma

• NO: difficili da localizzare 1/10000

MUTAGENESI mediata dai TRASPOSONI (P-elements etc.)

• SI: singolo evento facile da localizzare (gene reporter)

• NO: non random. Solo alcuni geni sono bersaglio.

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Elementi mobili in Drosophila

  • Il 15% del genoma di Drosophila è MOBILE
  • Esistono 80 tipi differenti di ELEMENTI TRASPONIBILI
  • Lunghezza tra 50-10.000bp (media 5Kb)
  • Da 1 a 1000 copie nel genoma (circa 50/genoma)
  • Molti sono specie specifici
  • ELEMENTO COPIA
  • ELEMENTO P: elemento mobile del genoma.
  • lunghezza variabile tra 500-2900 bp

Aggiunta RECENTISSIMA nel genoma di Drosophila Melanogaster

Studi del 1992 hanno osservato che gli elementi P provengono da un’altra specie

che ha “contaminato” la D.m. intorno al 1950.

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L’elemento P

Gli elementi P si muovono mediante

un meccanismo di COPIA e INCOLLA

Gli elementi P

sono presenti sui cromosomi

di TUTTI I TESSUTI ma

LA TRASPOSASI E’ ATTIVA

SOLO NELLE CELLULE

GERMINALI

STOP

ORF0-ORF1-ORF2

ORF0-ORF1-ORF2-ORF3

http://www.oup.co.uk/best.textbooks/

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L’elemento P

In presenza della TRASPOSASI, qualsiasi frammento di DNA posto tra le

regioni terminali invertite puo’ essere MOBILIZZATO

Tutto ciò che è

all’interno

delle seq ripetute

viene mobilizzato

L’elemento P si integra preferibilmente nelle estremità 5’-3’ del gene ospite

o tende ad inserirsi nelle vicinanze di altri elementi P ed ha una leggera

preferenza per sequenze target GGCCAGAC

CEPPO di DROSOPHILA con elemento P (circa 30-50 copie): ceppo P

CEPPO di DROSOPHILA senza elemento P: ceppo M

L’elemento P è CAUSA della DISGENESI DEGLI IBRIDI

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Disgenesi degli Ibridi

Incapacità di certi ceppi di Drosophila di incrociarsi in modo

Produttivo poiché generano ibridi sterili

(benché fenotipicamente simili)

Gli IBRIDI generati da questi incroci sono DISGENICI:

Aberrazioni cromosomiche

Mutazioni

Sterilità

Alterata segregazione alla meiosi

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Disgenesi degli Ibridi è ASIMMETRICA

L’elemento P è CAUSA della DISGENESI DEGLI IBRIDI

CEPPO di DROSOPHILA con elemento P: ceppo P

CEPPO di DROSOPHILA senza elemento P: ceppo M

http://www.oup.co.uk/best.textbooks/

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Disgenesi degli Ibridi

LA TRASPOSASI E’ ATTIVA

SOLO NELLE CELLULE

GERMINALI

(splicing)

Nel citoplasma

delle UOVA

di ceppo P

Elevati livelli

di

repressore

Riarrangiamenti

cromosomici

STERILITA’

Nel citoplasma

delle UOVA

di ceppo M

NO Repressore

SI Trasposasi

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PRODUZIONE DI DROSOPHILA TRANSGENICA con elemento P

+ TRASPOSASI

Elemento P come vettore per il trasferimento genico

Spradling and Rubin (Science 1982) sviluppano un sistema per l’integrazione

delle sequenze clonate nell’elemento P nei cromosomi della linea germinale

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PRODUZIONE DI DROSOPHILA TRANSGENICA con elemento P

  • PLASMIDE DONATORE:
  • transgene di interesse (tra seq ripetute invertite 5’P-3’P)
  • gene reporter (LacZ)
  • Gene marker (wt+ occhi rossi)
  • PLASMIDE conTRASPOSASI:
  • Codifica per trasposasi
  • Sequenza ripetuta 5’p difettiva TRASPOSASI INATTIVA

Embrione wt-/-

Iniezione dei 2 vettori in embrione precoce

DNA esogeno entra in alcune cellule

Nelle cellule della linea germinale: elemento P TRASPONIBILE

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ROSY -

ROSY -

ROSY +

ROSY -

ROSY +

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DROSOPHILA TRANSGENICA

  • “ENHANCER TRAP”
  • 2. SOVRAESPRESSIONE di TRANSGENI
  • 3. STUDIO DI PROMOTORI
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TECNICA dell’ENHANCER TRAP

Un enhancer trap contiene un promotore minimo, insufficiente di per sé, per indurre la trascrizione. Se, dopo la trasposizione si inserisce in una regione sotto l’influenza di un enhancer genomico, la sequenza inserita dovrebbe essere trascritta in maniera che riflette l’attività dell’enhancer.

  • Tecnica utilizzata per:
  • Identificazione di nuovi geni
  • Analisi dell’espressione di geni
  • tempo/tessuto specifici
  • 3) Permette analisi molti geni
  • simultaneamente
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TECNICA dell’ENHANCER TRAP

A) Enhancer TRAP P(LacZ) e B) Enhancer TRAP GAL4

  • A) Enhancer TRAP P(LacZ): gene reporter codifica per la beta-galattosidasi
  • L’attività dell’enhancer è localizzata tramite immunoistochimica o reazione con X-gal.
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LINEE “ENHANCER TRAP”

  • a) Banche di drosophila con pattern espressione, collezione di
  • oltre 4000 ceppi
  • b) Con incroci specifici si possono studiare vari pattern di
  • espressione
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B) Enhancer TRAP GAL4: sistema di Lievito. GAL4 attiva trascrizione di geni a valle di UAS (Upstream Activating Sequence)

Utilizzato per IDENTIFICARE NUOVI GENI e SOVRAESPRESSIONE di geni

LIEVITO

DROSOPHILA

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2) Enhancer TRAP GAL4 per identificazione di NUOVI GENI

GAL4 è prodotto SOLAMENTE se si inserisce sotto enhancer

Gene reporter (LacZ/GFP) è espresso solo se GAL4 lega la seq UAS

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GAL4/UAS

SOVRA-ESPRESSIONE/SILENZIAMENTO

di TRANSGENI

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GAL4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto/tempo specifica

Collezione di

ceppi di Drosophila

  • Promotore UBIQUITARIO
  • Promotore SPECIFICO (spazio)
  • Promotore Temp-SENS (tempo)

IL TRANSGENE (GENE X ) E’ ESPRESSO SOLAMENTE NEL TESSUTO SPECIFICO

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GAL4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto/tempo specifica

PROMOTORE

Tessuto specifico

ESISTONO MIGLIAIA di CEPPI di DROSOPHILA CHE ESPRIMONO GAL4 IN DIFFERENTI TESSUTI E STADI DIFFERENTI DELLO SVILUPPO

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GAL4/UAS

SOVRA-ESPRESSIONE/SILENZIAMENTO

di TRANSGENI

SPAZIO

TEMPO

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GAL4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto/tempo specifica

Tecnica molto utilizzata per studio di ONCOGENI

  • WT
  • MUTATO
  • DELETO
  • antisenso

WT

UAS/Cbl oncogene

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Studio del PROMOTORE

Drosophila puo’ essere un ottimo strumento per l’ANALISI del PROMOTORE:

identificazione di regioni NECESSARIE per la funzione del Promotore

Vengono prodotti MUTANTI di DELEZIONE fusi al gene LacZ

Il geni ibrido viene fuso nell’elemento P e inserito nell’embrione

L’attività della betagalattosidasi permette di identificare

La regione MINIMA del PROMOTORE e sequenze NECESSARIE alla sua regolazione

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Studio del PROMOTORE

Analisi del PROMOTORE del gene DRONC: caspasi di Drosophila essenziale per apoptosi durante lo sviluppo embrionale del moscerino.

Distinct promoter regions regulate spatial and temporal expression of the Drosophilacaspasedronc

T J Daish, D Cakouros and S Kumar

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intestino

ghiandole salivari