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DNA Sequencing Troubleshooting

speaker : Yen-Chin Liu 劉 燕 琹. DNA Sequencing Troubleshooting. Plasmid DNA. Annotation Ave Signal Intensity: G( 3018 ), A( 3397 ), T( 2496 ), C( 2817 ). Electropherogram. Raw. PCR product. Annotation Ave Signal Intensity:

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DNA Sequencing Troubleshooting

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Presentation Transcript

  1. speaker : Yen-Chin Liu 劉 燕 琹 DNA Sequencing Troubleshooting

  2. Plasmid DNA Annotation Ave SignalIntensity: G(3018), A(3397), T(2496), C(2817) Electropherogram Raw

  3. PCR product Annotation Ave SignalIntensity: G(2137), A(1395), T(1309), C(1875) Electropherogram Raw

  4. (1)沒有訊號 特徵： Eletrophorgram之圖示無訊號( No signal ) 原因： PCR反應失敗、(1-1)DNA濃度不足、(1-2)Primer濃度標示錯誤、 (1-3)沒有Primer黏合位點、(1-4)clone有問題 解決方式： 重新做定序反應排除人為失誤因素、(1-1a)提高DNA濃度、 (1-2a)檢視Primer濃度、(1-3a)檢視所有使用Primer的正確性、 (1-4a)請檢視clone 有無選殖成功、(1-4b)請檢視載體是否修改過 Ave SignalIntensity: G(32), A(37), T(40), C(34)

  5. (2)訊號雜亂 (2-1) Primer 專一度不佳 特徵： Eletrophorgram之圖示會發現訊號微弱且雜亂，定序讀不長， signal intensity lower，導致free big dye干擾 原因： Primer黏合效率不佳 解決方式： check Primer quality and Tm值，調整PCR annealing Tm (2-1a)重新設計Primer(最適Tm=50℃~55℃) 或更換Primer Ave SignalIntensity: G(44), A(46), T(49), C(48)

  6. (2)訊號雜亂 (2-2) DNA濃度不足 特徵： 分析軟體中Ave Signal Intensity : G、A、T、C皆小於(300)以下 Electropherogram之圖示發現序列讀到600bps後因DNA不足導致 訊號下降，background會拉高且序列讀不長 原因： 定序反應中，DNA template量過低 解決方式： 重新再一次定序反應，增加反應中DNA的template (2-2a)提高DNA濃度 原因： 定序反應中，DNA template量過低 解決方式： 重新再一次定序反應，增加反應中DNA的template (2-2a)提高DNA濃度 Ave SignalIntensity: G(101), A(69), T(76), C(71)

  7. (2)訊號雜亂 too much DNA template 特徵： Ave Signal Intensity : G、A、T、C皆大於(10000)以上 Eletrophorgram之圖示會有很強之background影響到major band之判讀 原因： 定序反應中，DNA template量過高 解決方式： 直接將上機之樣品重新以HiDi formamide稀釋後重跑 Ave SignalIntensity: G(13694), A(13557), T(12394), C(11252)

  8. (2)訊號雜亂 (2-3) Primer degraded (N-1,N-2) 特徵： Eletrophorgram 之圖示會發現major band peak下會有miner peak 而且miner peak可與後一個base相對應 原因： Primer品質不佳,有N-1情形 解決方式： (2-3a)確認Primer保存方式或更換使用fresh Primer

  9. (2)訊號雜亂 (2-4) Multiple templates 特徵： Eletrophorgram前面一段noise，且有明顯的終止點，其後的peak 又變得sharp 原因： 非專一性產物 解決方式： (2-4a)非單一產物請重新純化分離單一template

  10. (2)訊號雜亂 (2-4) Multiple templates 特徵： Eletrophorgram之圖示會發現一般前60-70bps序列是非常sharp 但是之後的序列會有很強的兩個peak重疊且訊號也不低 原因： 在點菌過程中挑菌污染，挑到two clones 解決方式： (2-4b)請重新純化單一菌落

  11. (2)訊號雜亂 (2-5) Multiple priming sites 特徵： • Eletrophorgram之圖示會發現有兩個訊號幾乎等高之peak • sinal intensity high • 序列一開始即很雜亂，two peak overlapping 原因： multiple primer binding area 解決方式： (2-5a)更換其他具有單一黏合位點的primer

  12. (2)訊號雜亂 (2-6)Frameshite mutation Point mutation ( SNP=single nucleotide polymorphism ) Insertion

  13. (2)訊號雜亂 (2- 7) 樣品品質不佳 (poor quality DNA) 特徵： Eletrophorgram之圖示會有很強之background影響到major band 之判讀且序列通常都讀不長 原因： 在PCR 過程中,因樣品本身製備過程不當或是遭到污染，例如:鹽 類,蛋白質,清潔劑或是其他抑制劑污染，進而影響到PCR的過程 解決方式： (2-7a)請完全去除定序反應中的抑制劑( salt, phenol, EDTA.. ) 處理前 Ave SignalIntensity: G(427), A(302), T(216), C(247) 處理後

  14. (3)訊號提前中斷 (3-1) Homopoly (T),(A),(G),(C) 特徵： Eletrophorgram 之圖示會發現訊號從poly A/T後開始訊號突然 低下且雜亂 原因： 連續poly A or T有可能形成hair pin structure導致PCR 過程中 primer binding mismatch因而影響後面序列之判讀 解決方式： 調整使用可解除二級結構之試劑或是反應之條件 (3-1a)建議更換另一端primer

  15. (3)訊號提前中斷 (3-2) Secondary structure (Repeat sequence, hair pin, siRNA) 特徵： Eletrophorgram 之圖示會發現訊號從二級結構位點開始訊號突然 低下且雜亂 原因： DNA self-ligation或是形成hair pin /loop structure 解決方式： (3-2a)建議更換另一端primer (3-2b)使用二級結構試劑( dGTP, DMSO.. )

  16. (4)染料波峰干擾 (4-1) 殘存過多染料 (big dye) 特徵： Eletrophorgram之圖示在70-80bp及110-120bp有很強signal， 影響major peak的判讀 原因： PCR反應中DNA濃度過低 酒精沉澱不完全，有ddNTP螢光殘留( free Big dye ) 解決方式： 重新PCR，調整DNA濃度 酒精沉澱步驟確實 (4-1a)可利用人工方式進行判讀

  17. 其他 Clogged capillary array 所造成 Capillary has bubble 所造成

  18. 特徵： Eletrophorgram之圖示會不隨機出現，再不特定的位置產生雜訊 干擾結果 原因： 毛細管中有雜質或氣泡影響DNA migration 解決方式： 重新更換位置重跑一次

  19. Thanks for your attention

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