Struktura a funkce buněčného jádra

1. Mgr. Andrea Benedíková MUDr. Josef Srovnal Struktura a funkce buněčného jádra Laboratoř experimentální medicíny DK LF UP a FN Olomouc

2. Cíle semináře • Seznámit posluchače se strukturou buněčného jádra a chromozómů • Popsat hlavní funkci buněčného jádra – replikace, transkripce • Poukázat na možnosti léčebného ovlivnění procesů na úrovni buněčného jádra

3. Prokaryota vs. Eukaryota • Přítomnost x nepřítomnost jádra = základ pro třídění všech živých organismů • eu = opravdu, karyon = jádro • pro = před

4. Buněčné jádro Jádro lidské buňky: • 5-8 μm v průměru • 10% objemu buňky • DNA 3x109 bp (haploid) (1 milion stran textu) • celková délka DNA 2 m • 2x 23 chromosomů (od matky a otce) • 23 tisíc genů

5. Struktura jádra • jaderný obal • jaderné membrány • jaderné póry • filamenta • jaderná matrix • chromatin • jadérko

6. Jaderný obal Prokaryota vs. eukaryota • Proč obal? • Ochrana DNA při aktivitě cytoskeletu

7. Jaderné póry • složeny z proteinových podjednotek • kanály naplněné vodou – malé molekuly rozpustné ve vodě • větší molekuly – tzv. jaderný lokalizační signál

8. Intermediární filamenta • Nukleoskelet - komplexní struktura analogická cytoskeletu složená z jaderná laminy a několika typů filament nutných pro průběh replikace DNA, vazbu chromatinu a integritu jádra • pevnost v tahu • fce = vydržet mechanický stres

9. Jaderná matrix • Eukaryontní chromosom – chromatin = komplex DNA + proteinůBakteriální chromosom – cirkulární molekula DNA • Heterochromatin - trvale v kondenzovaném stavu • Euchromatin - v interfázi dekondenzován, v mitóze kondenzován

10. Jadérko = nucleolus • chromozomy s geny pro rRNA • transkripce genů pro rRNA a tvorba ribozomálních podjednotek

11. Chromozomy Eukaryontní DNA je uspořádánadochromozomů. Chromozom - dlouhá lineární DNAsbalená pomocí proteinů dosložitějších struktur umožňujícíchsnadné rozbalení a sbalení, čili úžasnou archivaci a zároveň rychlé čtení (milion stran textu v každé buňce). Struktura chromozomu se mění během buněčného cyklu (M-fáze – kondenzovaný, neaktivní, interfáze – dekondenzován, aktivní, transkripce).

12. Chromozomy • 2 kopie každého chromozomu = homologní chromozomy • jediný nehomologní pár – pohlavní chromozomy samců (XY)

13. Struktura genu na chromozomu • Regulační sekvence – vazba proteinů ovlivňujících transkripci • Eukaryontní geny jsou přerušovány nekódujícími sekvencemi = introny • Kódující sekvence = exony • Intronové sekvence jsou z primárního RNA transkriptu vystřiženy (setřih RNA = RNA splicing). Vzniká molekula mRNA.

14. Struktura nukleozomu Nukleozom = základní jednotka kondenzace chromatinu • Nukleozom tvořen jádrem z osmi histonových molekul obtočených DNA • Nukleozomy spojeny spojníkovou DNA • Každý nukleozom = 200 nukleotidových párů DNA • Kolem jádra nukleozomu 2 neúplné otočky DNA = 146 nukleotidových párů

15. Histony • Malé proteiny s vysokým obsahem kladně nabitých aminokyselin – vazba na negativně nabitou cukr-fosfátovou kostru DNA • V jádře nukleozomu po dvou molekulách typy H2A, H2B, H3 a H4 • Histonů je v buňce značné množství (kolem 60 milionů molekul od každého typu v jedné buňce) a jejich celková hmotnost je přibližně stejná jako DNA samotné

16. Nukleozomy Chromatin – 30 nm silné vlákno Dekondezace – nukleozomy („korálky na niti“) • Nukleozom = nukleozomové jádro + sousední spojovací úsek DNA • omotání DNA kolem nukleozomu – zkrácení molekuly DNA přibližně o 1/3 její původní délky

17. Kondenzace do 30-nm vlákna - histon H1 • Globulární jádro histonu H1 drží sousední nukleozomy u sebe v pravidelně se opakujícím uspořádání

18. Úrovně kondenzace chromatinu • Předpokládané stupně kondenzace DNA vedoucí až ke struktuře vysoce kondenzovaných mitotických chromozomů

19. Funkce buněčného jádra • replikaceDNA • transkripce • processing, splicing RNA • tvorba a transport ribosomálníchpodjednotek • transport mRNA do cytosolu

20. Replikace • Replikace – v S-fázi buněčného cyklu (synthesis) • Zdvojení nejenom DNA, ale i histonů a jaderných proteinů • Na konci S-fáze (8hodin) – dvě kopie chromozomu spojené centromerou • laboratorní využití – metoda PCR

21. Replikace • Vlákna DNA komplementární – obě slouží jako templát • Replikace – vznik dvou nových dvojšroubovic DNA, které jsou věrnými kopiemi mateřské molekuly

22. Specializované sekvence DNA zajišťující účinnou replikaci chromozomů • Každý chromozom má mnoho počátků replikace, jednu centromeru a dvě telomery

23. Replikační počátky • DNA za normálních podmínek velmi stabilní – vodíkové můstky • narušení – teplota okolo 100 °C • v buňce - iniciační proteiny • speciální nukleotidové sekvence - rozpoznávány iniciačními proteiny a snadné oddělení řetězců (enzym DNA-helikáza) • po navázání iniciačních proteinů na DNA a otevření dvojšroubovice se na replikační počátek váží proteiny spolupracující na syntéze nového vlákna

24. Replikační vidličky • začátky replikace mají typický tvar Y – replikační vidličky - navázány proteiny replikačního aparátu – pohyb ve směru replikace, rozvíjení dvojšroubovice za současné syntézy nového řetězce

25. DNA-polymeráza • nejdůležitější enzym replikačního aparátu • připojena k DNA pomocí speciálního proteinu, během replikace zůstává navázána na DNA a pohybuje se podél ní • polymerační aktivita (5´-3´) - katalyzuje připojování nukleotidů na 3´-konec rostoucího řetězce DNA • nukleázová aktivita (3´-5´) – štěpení nukleových kyselin při opravě špatně navázaného nukleotidu (korektura) (1 chyba na 107 navázaných nukleotidů)

26. Okazakiho fragmenty • syntéza DNA pouze ve směru 5´-3´ • vedoucí a opožďující se řetězec • Ve směru 3´-5´ prodlužována DNA diskontinuálně po krátkých úsecích = Okazakiho fragmenty

27. RNA jako primer pro syntézu DNA • DNA-polymeráza schopna vázat nukleotid pouze na předchozí komplementární nukleotid (viz. korektura) • Nutno enzym schopný spojit dva volné nukleotidy a začít syntetizovat nové vlákno podle jednořetězcové DNA • Primáza – syntéza RNA = primer pro syntézu DNA – poskytne 3´-konec pro DNA-polymerázu • RNA-primery nakonec odstraněny nukleázou a nahrazeny DNA pomocí DNA-polymerázy, úseky nakonec spojeny DNA-ligázou

28. Přehled enzymů účastnících se replikace • DNA-helikáza – oddělování mateřských řetězců DNA • Primáza – syntéza RNA jako primeru pro syntézu DNA • DNA-polymeráza – syntéza DNA řetězce • Nukleáza - štěpí primerovou RNA • DNA-ligáza – spojení úseků DNA do jednoho řetězce

29. SSB-proteiny (Single-strand binding proteins) • součást replikačního aparátu - proteiny vázající se na jednořetězcovou DNA a chránící ji (po rozpletení helikázou) před znovuspárováním

30. Svírací protein (Sliding clamp) • Součást replikačního aparátu – pevně váže DNA-polymerázu na templát, na opožďujícím se řetězci ji navíc uvolňuje po dokončení syntézy každého Okazakiho fragmentu

31. Replikace

32. Transkripce = přepis krátkého úseku DNA do RNA – vzniká RNA komplementární k jednomu řetězci DNA • v některých krocích podobná replikaci • další krok = translace (překlad) RNA – syntéza proteinů – probíhá na ribozomech

33. Transkripce • Začíná jako replikace rozvolněním dvojšroubovice DNA - 1 z řetězců slouží jako templát • Oproti nově vznikající DNA však nezůstává RNA spojena s templátovou DNA – po přidání nukleotidu dochází k obnovení dvojšroubovicové struktury DNA a vytěsnění vlákna RNA

34. RNA-polymeráza • přepis DNA do RNA • opět 5´-3´ polymerační aktivita • nemá 3´-5´ nukleázovou aktivitu – neschopna oprav – transkripce méně přesná než replikace (1 chyba na 104 přepsaných nukleotidů) – RNA není určena jako DNA k trvalému uchování genetické informace

35. Posttranskripční úpravy (RNA processing) • Bakterie – DNA volně v cytoplazmě, zde i ribozomy • Eukaryontní DNA – v jádře, transkripce probíhá v jádře – RNA poté transportována z jádra do cytoplazmy jadernými póry • před opuštěním jádra - posttranskripční úpravy primárního transkriptu • přidání čepičky • polyadenylace - vystřiženy introny = sestřih RNA (RNA splicing)

37. Léčiva směřující do buněčného jádra • Inhibice biosyntézy NK – analoga • Poškození struktury a funkce NK – alkylace, interkalace, inhibice topoizomeráz • Alterace mikrotubulárních proteinů Léčiva ovlivňující dělení buněk: Cytostatika, imunosupresiva, antivirotika

38. Inhibice biosyntézy NK - analoga Analoga: aktivována a inkorporována do NK – zástava replikace, transkripce, nesprávný kód Indikace: nejčastěji hematologické malignity Dělíme na: • Analoga kyseliny listové • Purinová analoga • Pyrimidinová analoga

39. Poškození struktury a funkce NK Účinek: poškození struktury a funkce NK má za následek inhibici replikace a transkripce. Indikace: nejčastější cytostatika, solidní tumory Dělíme dle mechanismu poškození NK na: • alkylace – kovalentní vazba • interkalace – nekovalentní vazba • inhibice topoizomeráz (topoizomerázy jsou nukleární enzymy důležité pro replikaci – riziko překroucení dvojšroubovice a vznik zlomů)

40. Alterace mikrotubulárního proteinu Mitotické jedy – alterace mikrotubulů poškodí funkci dělícího vřeténka – omezená migrace chromosomů při mitóze. Většina omezuje syntézu tubulinu. Polymerizace – v rovnováze s - depolymerizaci • Inhibitory polymerizace – inhibice syntézy • Inhibitory depolymerizace – inhibice rozpadu

41. Molecular Biology ofthe Cell, FourthEdition BruceAlberts, Alexander Johnson, JulianLewis, Martin Raff, KeithRoberts, Peter Walter 28/02/2002 1616 pages Úvod do molekulární biologie Stanislav Rosypal, 4. vydání, 2006 Přednáška volně ke stažení na: www.lem.ocol.cz

42. Děkuji za pozornost Mgr. Andrea Benedíková Laboratoř experimentální medicíny DK FN a LF UP Olomouc Tel: +420 585 853 225 Email: benedikova.andrea@seznam.cz www.lem.ocol.cz