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TRANSFECCIONES Maestría en Biología Molecular Médica 2006

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TRANSFECCIONES Maestría en Biología Molecular Médica 2006. La introducción de DNA en las células procariontes y levaduras se llama Transformación La transformación de células eucariontes superiores se refiere a cambios en las características del cultivo celular

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TRANSFECCIONES Maestría en Biología Molecular Médica 2006


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    Presentation Transcript
    1. TRANSFECCIONES Maestría en Biología Molecular Médica 2006

    2. La introducción de DNA en las células procariontes y levaduras se llama Transformación • La transformación de células eucariontes superiores se refiere a cambios en las características del cultivo celular • Por ello se utiliza el término transfección para denominar la entrada de DNA foráneo a la célula

    3. Fibroblastos humanos COS

    4. Cultivos celulares • Cultivos primarios • Lineas celulares establecidas Por transformación con oncogenes Provenientes de tumores

    5. Curva de cultivos celulares Germinales (telomerasa activa) TRF Somáticas (telómeros se acortan telomerasa inactiva) Células inmortales (tel.activa) Extensión de la vida celular senecencia crisis Divisiones celulares

    6. TRANSFECCIONES • OBJETIVOS • Expresión de proteínas para su purificacón • Expresión de proteínas para estudiar su efecto sobre el fenotipo celular • Estudio de promotores y elementos regulatorios • Estudio de mecanismos involucrados en el procesamiento del RNA, postraduccionales, etc. • Interacción de proteínas • Clonado • Terapia génica

    7. Problemas que pueden surgir de expresar proteínas en sistemas procariontes • Inestabilidad • Sin actividad biológica • Contaminantes procariontes • Características bioquímicas diferentes

    8. Modificaciones postraduccionales imcompletas o ausentes • Clivaje proteolítico • Glicosilación • Alteraciones de los aminoácidos • fosforilación • acetilación • Sulfatación • Adición de ácidos grasos

    9. Métodos de Transfección Depende del tipo celularHeLa, HEK 293T, COS7, Liposomas alta eficiencia, no-tóxicoe.g. Lipofectamine Plus (Invitrogen), Tfx20 (Promega) Fosfato de calcio simple, baja eficiencia DEAE-dextrano simple, alta efficiency, no para estable Electroporación alta eficiencia, altos niveles de muerte Microinyección laborioso, alta eficiencia Biobalística para células vegetales Retrovirus muy eficiente, trabajoso

    10. Liposomas: mezcla Moléculas lipídica catiónicas (N,N,N´,N´-tetramethyl-N,N´-bis(2-hydoxyethyl)-2,3-di(oleoyloxy)-1,4-butane-diammonium iodide) Y de un lípido neutro L-dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE).

    11. Electroporación

    12. Electroporación para células pegadas

    13. Biobalística

    14. Microinyección

    15. Métodos de transfección

    16. Vectores de expresión eucariontes • Elementos para clonado en bacterias • ori de replicación • Marcador de selección bacteriano • Sitios múltiples de clonado

    17. Elementos específicos de vectores eucariontes _ Promotor eucarionte • Señal de poliadenilación • Secuencias Kozak y codón ATG • Intrón • Tags-proteínas de fusión • ori de replicación eucarionte como el de SV40 (opcional) • Marcador de selección para células eucariontes (para transfecciones estables) • Segmentos de DNA para recombinación homóloga

    18. Vector de expresión eucarionte

    19. Promotores eucariontes Constitutivos: • SV40 • RSV • CMV • hEF-1a • Ubc Inducibles: • Tet o T-Rex inducilbe por tetraciclina • Olac inducible por IPTG • Metalotioneína inducible por metales pesados • GAL4-E1b inducible por mifepristona

    20. Tags • Glutation-S-transferasa • His • V5 • Hemoaglutinina (HA) • Myc • Flag • EGFP

    21. Elementos de control de la traducción Región transcribible del gen 5’ leader 1 2 3 4 gen de interés 5 3’ trailer • 1AUG (secuencia Kozak = CCRCCAUGG) • 2 Secuencia señal de secreción • 3 Tag para su purificación • Sitio de clivaje proteolítico • Señal de poliadenilación

    22. Transfección transiente • (48-72 horas) • Análisis rápido • Múltiples propósitos • Análisis de secuencias regulatorias

    23. Vector de expresión

    24. Vector de expresión

    25. Proteínas producidas en cultivos de células eucariontes • Proteína Condición • Factor IX & VIIIc hemophiliacs • CD4 receptor AIDS • erythropoetin cancer • b & g interferons cancer • Interleukin-2 cancer • growth hormone dwarfism • tissue plasminogen activator heart attack/stroke • Hepatitis B surface antigen vaccine • monoclonal antibodies various

    26. Vector de fusión a EGFP

    27. Vector de fusión a ZsYellow

    28. Expresión de proteínas fluorescentes Proteína fluorescente verde

    29. Vector de anclaje a membrana de la proteína

    30. Vector de secreción de la proteína

    31. Dos vectores de expresión diferentes • El número de copias de cada plásmido puede ser diferente • La expresión de cada proteína puede ser diferente

    32. Vectores que expresan dos genes • Cada gen es una unidad transcripcional y tiene su promotor y secuencia de poliadenilación • Pueden no expresar la misma cantidad de protína

    33. Vectores dicistrónicos • Posee un solo promotor • 2 genes a partir de la misma unidad transcripcional • Se sintetiza un solo mRNA • Necesita un sitio interno de unión al ribosoma • IRES proviene del genoma de virus de mamíferos

    34. Vectores dicistrónicos

    35. 5’ 3’ PROMOTOR exón 1 intrón exón 2 transcripción Gen reportero para análisis de promotores 5’ 3’ mRNA AAAAAA m7GpppN La mayoría de los cambios en los niveles de mRNA ocurren por variaciones en la transcripción. ANALISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA

    36. 5’ 3’ PROMOTOR exón 1 intrón exón 2 PROMOTOR GEN REPORTEROe.g. luciferasa Estrategia de genes reporteros Los genes reporteros son secuencias que codifican para proteínas de simple detección. Se usan para reemplazar productos génicos difíciles de medir y determinar actividad promotora.

    37. Genes reporteros CAT (cloramfenicol acetiltransferasa)Transfiere grupos acetilos marcados 14C o 3H al cloramfenicol.La detección se da por cromatografía en capa delgada o extracción orgánica GAL (-galactosidasa)Hidroliza sustrato incoloro (ONPG) para dar producto amarillo que se cuantifica SEAP (secreted human placental alkaline phosphatase)Ensayo de fosfatasa alcalina bioluminiscente. Muy sensible LUC (luciferasa)Oxida a la luciferina emitiendo fotones. Los fotones se cuentan en un luminómetro o una cámara de recuento de fotones (ensayo in vivo). Hay diferentes luciferasas dispoinibles GFP (green fluorescent protein)Fluoresce por irradiación con UV – se observa con microscopio de fluorescencia.

    38. Vector para analizar secuencias promotoras.

    39. Vector para analizar secuencias promotoras.

    40. Vector control-secuencias regulatorias

    41. Vector control-secuencias regulatorias

    42. Gen reportero (ej luciferasa) Ensayo de genes reporteros Diseño y construcción del vector Introducción en células por transfección transiente o estable Ensayo de actividad Gen control (ej b-galactosidasa) Cálculo de actividad promotora

    43. Vector control de eficiencia de transformación

    44. Vector control de eficiencia de transformación

    45. Co-transfección de genes reporterosDual Luciferase Assay system - Promega Se clona el promotor de interés delante del gen de luciferasa (firefly) y se usa la luciferasa de Renilla como control interno La luciferasa de Renilla se expresa de un promotor constitutivoe.g. SV40 I/E HSV TK

    46. Ejemplo de resultado