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Gelelektrophorese am Isas

Gelelektrophorese am Isas. SDS-Page 2D. SDS-PAGE. Natrium – Dodecyl – Sulfat – Polyacrylamid Gelelektrophorese Kontinuierliche PAGE Diskontinuierliche PAGE Durch SDS Proteine entfaltet, 1 Nettoladung proportional zur Molekülgröße. 2D -PAGE.

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Gelelektrophorese am Isas

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Presentation Transcript

  1. Gelelektrophorese am Isas SDS-Page 2D

  2. SDS-PAGE • Natrium – Dodecyl – Sulfat – Polyacrylamid Gelelektrophorese • Kontinuierliche PAGE • Diskontinuierliche PAGE • Durch SDS Proteine entfaltet, 1 Nettoladung proportional zur Molekülgröße

  3. 2D -PAGE • Separation der Proteine nach 2 physikalischen Parametern • Auch orthogonale Seperation • 1. Dim.: Separation durch isoelektrischen Punkt • 2. Dim.: Separation nach elektrophoretischen Trennverfahren

  4. Nachweißgrenze Cells Molekülmasse Proteine Peptide Aminosäuren Trennungskapazität

  5. Arbeitsschema für 2D-PAGE 1. Dimension ‚Probenbehälter‘ pH 10.0 pH 3.0 IPG-strip

  6. - + Proteine wandern im elektrischen Feld zu ihren isoelektrischen Punkt

  7. 1. Dimension IPG-Strips: • Im Handel erhältliche Gel-Streifen mit unmobilen und eingestellten pH-gradient (pH 3-10 )

  8. Vorbereitung da Streifen im Schiff transportiert wurden sind diese dehydratisiert (längere Lagerung) Rehydratisierung ist nötig Für 24 cm Streifen sind 450 µL nötig Mischung aus 8M Harnstoff 2M Thioharnstoff 2% CHAPS 0.002% Bromphenol blau 2% IPG-Puffer

  9. Isoelektrische Fokusierung • Assembly of IEF-System • Streifen in Vorrichtung (Streifenhalter) • Elektroden an das Gel anschließen • Proben aufs Gel/Streifen geben • Streifen mit Öl abdecken • Ungefähre Laufzeit 20h !!!!

  10. Vorbereitung für 2 Dimension • Re-puffering von IPG-Streifen • Reduktion and Alkylierung Schritt • Streifen auf 2 Gel packen und laden • Gel mit Agarose Lösung auffüllen, so dass Streifen gut aufliegt

  11. 2. Dimension • Ungefähre Laufzeit 4h

  12. Färbung • Colloidal Coomassie (G-250) • 34% Methanol • 2% Phosphorsäure • 17% Ammoniumsulfat • 0,066% Coomassie • Silber Färbung

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