- La mitose - mécanismes - « points de contrôles » - L’épigénome - méthylation de l’ADN

1. - La mitose • - mécanismes • - « points de contrôles » • - L’épigénome • - méthylation de l’ADN • - « code histone » • - méthode d’analyse

2. La mitose : Rappel des étapes Metaphase Interphase Prophase Anaphase Prometaphase Telophase Cytokinesis

3. Rôle du centromère au cours de la mitose : Maintient des liens entre chromatides sœurs avant l’anaphase Assemblage du « kinetochore », positionnement du chromosome sur la plaque métaphasique Le kinétochore est le site d’ancrage des microtubules.

4. Rappel de la structure du centromère (voir cours du 23 09 04) Le centromère se forme sur l’ADN centromèrique – 1 par chromosome Le centromère est dans un état chromatinien spécialisée – H3 remplacé par CENP-A… – Séquences centromèriques – séquences alphoïdes (1 et 2) Des protéines centromèriques s’associent au centromère : - protéines centromériques constitutives (présentes tout le temps) - protéines « passagères » - présentes de manière transitoire au cours de la mitose uniquement

5. Les protèinescentromériques Kinétochore Protéines centromèriques constitutives Protéines duKinétochore Protéines centromèriques passagères CENP-A CENP-B CENP-C Mis12 CENP-H CENP-I Aurora B Survivin INCENP Chromosome passenger complex (CPC)

10. Les Microtubules • MTs : polymères protèiques cylindriques, vides • assemblé à partir d’hétérodimères de a / b-tubuline • s’associent longitudinalement pour former des protafilaments • 13 protafilaments s’associent latéralement pour former un « lattice » de MT • polarité + et -. La b-tubuline = + • l’hydrolyse de GTP lié à la b-tubuline contrôle la stabilité du polymére • MTs forment le fuseau mitotique • – amorcé à partir des centrosomes • – assemblé sur le kinétochore / chromatides soeurs(« K fibers ») • Régulation par MAPs (« microtubule associated proteins ») • - Exprimées à des taux constants au cours du cycle • - Activité régulée par phosphorylation

11. Les microtubules Kline-Smith, Mol Cell 2004, vol 15, pp317-327

12. « Turnover » global des microtubules Equilibre entre facteurs « catastrophique » et facteurs « rescue » - MCAK « mitotic centromere associated kinesin « catastrophe » - XMAP215 / TOG - assemblage

14. « Horloges cellulaires » régulent la durée des différentes phases du cycle cellulaire • « Points de contrôle » cellulaires (« checkpoints ») assurent la démarrage de chaque phase sucessive à la fin de la phase précedente Nasmyth et al, Science, vol 297, p559, 2002

15. Régulation de la mitose Notions d’horloge et de points de contrôle « timers » et « checkpoints »

16. Skibbens et al, Annu Rev Genet, 1998

18. APC – Anaphase Promoting Complex Ubiquitin Ligase régulé au cours du cycle cellulaire Rajout de petites proteines ubiquitines sur des substrats Ciblage pour la dégradation protéique via le protéasome

22. Separase – Cysteine protease

23. Sortie de la mitose

24. Protéines liant le kinétochore qui contrôllent la mitose • Point de contrôle « fuseau mitotique » (inhibition de l’APC) • Durée de la mitose Mad1 Mad2 Mad3/BubR1 Bub1 Bub3 …identifiées chez la levure S. cerevisiae, consérvées chez les mammiféres

26. Expériences de SiRNA Mad2 et Mad1 dans des cellules HeLa Meraldi et al, vol 7, pp45-60, Dev Cell 2004

29. Meraldi, Dev Cell, Volume 7, Issue 1 , July 2004, Pages 45-60

30. Les kinases auroras Nat Rev Mol Cell Biol, 2003, vol 3, p842 Andrews - Curr Opin Cell Biol. 2003 Dec;15(6):672-83.

31. Rôles des kinases Aurora au cours de la mitose - résumé • Aurora A • – assemblage du fuseau mitotique • Aurora B • Histone H3 phosphorylation sur serine 10 • Inhibition de MCAK • « spindle assembly checkpoint » +++++ CPC (INCENP, Survivin, Aurora B) • Cytokinesis (division cellulaire)

33. Cahill, Nature 1998

34. Défaut du « mitotic spindle checkpoint » - aneuploidie Lymphome T périphérique

35. 1. La mitose • - mécanismes • - « points de contrôles » • 2. L’épigénome • - méthylation de l’ADN • - « code histone » • - méthodes d’analyse • 3. Analyse d’article

36. L’épigénétique : L’étude des modifications biochimiques de la chromatine qui contrôllent sa fonction. Ces modifications sont transmissibles au cours des la mitose ou de la méiose et sont réprogrammables • Méthylation des cytosisines au niveau des dinucleotides CpG(Me-cytosine – « 5éme base ») • Modifications post-traductionnelles des histones L’épigénome = la totalité de l’information épigénétique d’une cellule

37. Exemples de régulation épigénétique du génome • - Inactivation du chromosome X • Empreinte génétique • Contrôle des récombinaisons V(D)J dans le tissue lymphoïde • Régulation transcriptionnelle au cours du dévélopment différentiation • (gènes Hox)

39. Méthylation de l’ADN DNMTases – DNA methyltransférases (de novo, maintient) Me-CpG – lu par de protéines a MBD (methyl DNA Binding Domain) - les protéines MBDs contiennent des domaines de répression transcriptionnel / recrutement de complexes répresseurs comme les HDACs

40. Etude de la méthylation de l’ADN : • PCR / enzyme sensible à la méthylation • Séquencage bisulphite (stabilité du CpG en présence de bisulphite) • Cytosines non méthylés -> U -> T • - Puces ADN • Autres – anticorps anti-MBD / ChIP ou « ChIP on Chip »

45. Modifications de la chromatine Analyse – essai ChIP / ChIP-chip ChIP ; Chromatin immunoprecipation