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DIAGNOSTIC MOLECULAIRE. Diagnostic de sujets atteints : diagnostic de certitude Diagnostic chez les porteurs sains (maladies récessives) permet le conseil génétique diagnostic des femmes porteuses Diagnostic prénatal Diagnostic préimplantatoire Diagnostic prédictif.

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Presentation Transcript
slide1

DIAGNOSTIC MOLECULAIRE

  • Diagnostic de sujets atteints : diagnostic de certitude
  • Diagnostic chez les porteurs sains (maladies récessives)
        • permet le conseil génétique
        • diagnostic des femmes porteuses
  • Diagnostic prénatal
  • Diagnostic préimplantatoire
  • Diagnostic prédictif
slide2

COMPLEXITE DU CHAMP D’APPLICATION

  • Très nombreuses maladies génétiques – très nombreux gènes
  • Phénotypes parfois mal définis
  • Anomalies spécifiques d’une maladie – Stratégies d’étude spécifiques
  • Capacité de réponse d’un patient à une molécule thérapeutique :
  • Phamacogénétique
slide3

Méthodes utilisées pour le diagnostic génotypique

DIAGNOSTIC DIRECT

1 – Recherche de mutations ponctuelles

- mutation connue

- screening d’un gène : séquençage, DHPLC, HRM

2 – Recherche d’amplifications de triplets

3 - Recherche de délétions

DIAGNOSTIC INDIRECT

slide4

Dans un microtube :

  • ADN à amplifier ou
  • matrice : 50ng à 500ng
  • les 2 amorces
  • -dNTP
  • -Taq Polymérase
  • -tampon avec Mg++
  • Volume final : 20 l à 100 l
  • Appareil : Thermocycler
slide7

B – ASO Allele specific oligonucleotide

1 - PCR + DOT BLOT (dépôt sur membrane)

2 - hybridation par oligosondes spécifiques

de la séquence normale

de la séquence mutée

slide10

The line-probe assay (LiPA)

Biotinilated

primer

slide12

C – ARMS test

ou allele specific PCR

slide13

D– test OLA

PEO : Penthaethylene oxide units

marquage fluorescent

FAM

HEX

TET

  • La sonde commune peut être marquée avec un fluochrome différent dans les PCR multiplex
  • - Chaque sonde spécifique doit avoir une taille différente
slide14

Oligonucleotide ligation assay OLA

Application de la technique OLA à la recherche des principales mutations du gène CFTR (mucoviscidose)

slide16

Séquençage

4 mélanges sont préparés:

- le fragment qui doit être séquencé

- un petit morceau d'ADN dont la séquence est complémentaire à l'extrémité 3' du fragment à séquencer = amorce

- les 4 dNTP's (dCTP, dATP, dGTP, dTTP)

- l'ADN polymérase

(vecteur)

slide17

L'utilisation d'un ddNTP permet d'obtenir un ensemble de fragments d'ADN de différentes tailles, correspondant aux emplacements d'un nucléotide donné

exemple: synthèse du brin complémentaire, et arrêt aléatoire par un ddGTP quand il y a une Cytosine sur la séquence

slide21

DHPLC

Dans des conditions de dénaturation partielle, le temps de rétention sur colonne de

chromatographie liquide est différent pour les homoduplexes et les hétéroduplexes.

slide23

HRM

Après PCR en présence d’un intercalant fluorescent

cette technique permet, en appliquant une

montée en T° très progressive, de discriminer

des variants.

La dénaturation provoque la baisse de la fluorescence

puis son extinction quand la dénaturation est complète.

Chaque séquence a donc une courbe de fusion qui

lui est propre.

Une modification de cette courbe signale la présence

d’une anomalie.

slide24

2 – Recherche d’amplifications de triplets

Exemple du X Fragile

- par PCR

  • Possibilité d’amplifier jusqu’à 80 répétitions
  • Hommes - si > 80répétitions = pas de signal
  • femmes – un seul signal = sujet homozygote
          • ou sujet présentant une
          • mutation complète
slide26

Par Southern blot

EagI

EcoRI

FMR1

EcoRI

(CGG)50

sonde

EagI

EcoRI

FMR1

EcoRI

(CGG)500

sonde

slide27

Coupure EcoRI + EagI et SOUTHERN BLOT

N

N

PM

PM

MT

MT

MUTE

PREMUTE

X INACTIF

NORMAL

X INACTIF

5,2 kb

PREMUTEX ACTIF

2,8 kb

NORMAL

X ACTIF

slide29

3- Recherche de délétions

2-1 Délétions de petite taille

PCR simple ou multiplex

Southern

MLPA

QMPSF

2-2 Délétions des télomères : MLPA

3-3 Délétions de grande taille : CGH array

slide32

Recherche de délétions par PCR multiplex

Exemple de la myopathie de Duchenne et de Becker

slide35

Primer design

Multiplex PCR reaction : same stringent PCR conditions

Control

Patient

1A

1B

ZIC2 TGIF SIX3 SHH SHH Ctrl gene SHH SIX3 TGIF ZIC2

2A

2B

stabilization Forward primer Reverse primer stabilization

tail+6FAM Target specific sequences tail

Control - Patient

PCR

1A

1B

2A

2B

Denaturation

Target 1 fragment

Target 2fragment

Fragment Analysis

QMPSFQuantitative Multiplex PCR of Short Fluorescent Fragments

  • Peak size normalization

based on endogenous peak of control gene

  • Visual analysis
slide36

MLPA (1)Multiplex Ligation dependant PCR Amplification

Probe design

Synthetic oligonucleotide M13 derived oligonucleotide

1A

1B

Control

2A

2B

Primer XTarget specificStufferPrimer Y

binding sitesequences sequencebinding site

Patient

Multiplex hybridization and ligation

No ligation of mismatched

probes

1A

2A

1B

1B

2A

2B

Target 1

Target 1

Target 2

PCR with universal primers X and Y

No exponential amplification

of non ligated probes

XY

  • Peak size normalization
  • Ratio =

R = 1.5 duplication

R = 1 normal

R = 0.5 deletion

Patient peak

Control peak

Fragment Analysis

slide39

DIAGNOSTIC INDIRECT

  • INDICATIONS
  • - gène localisé dans le génome mais non cloné
  • gène connu, mais mutation non identifiée
  • exemple de la myopathie : recherche des filles vectrices
  • délétion non détectable chez les filles (sauf PCRq)
  • PRINCIPE
  • identification du chromosome porteur du gène muté à l’aide
  • de marqueurs polymorphiques situés à proximité du gène
  • - liaison génétique
  • CONTRAINTES
  • - disposer d’un enfant atteint
  • risque de recombinaison
slide40

Liaison génétique

A1

A3

B2

B4

Gène N

Gène M

C2

C3

D4

D1

A1

B4

Gène M

C3

D4

slide44

Allèle 1

Allèle 2

2 -2

1 -1

1 -2

1 -2