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RNAS Y no codificantes son requeridos para la Replicación de ADN cromosómica en Humanos.

RNAS Y no codificantes son requeridos para la Replicación de ADN cromosómica en Humanos. Christov PC, Gardiner JT, Szuts D and Krude T. Replicación. Introducción.

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RNAS Y no codificantes son requeridos para la Replicación de ADN cromosómica en Humanos.

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Presentation Transcript

  1. RNAS Y no codificantes son requeridos para la Replicación de ADN cromosómica en Humanos. Christov PC, Gardiner JT, Szuts D and Krude T.

  2. Replicación

  3. Introducción • RNAs no codificantes regulan muchos procesos biológicos: expresión de genes, dinamica de la cromatina, replicación?? de DNA ecucariota. • Sistema libre de celulas: replicación cromosomalsemiconcervativa, (Núcleo y comp para la replicación) • Purificación de un nuevo factor RNA Y nocodificante de una fracción como herramienta de replicación.

  4. MATERIAL Y MÉTODO • Se aisló de células Hela los factores que se creen que son requeridos para la iniciación de la replicación del DNA. • 2 fracciones QA y QB • QA contiene RPA (proteína de replicación A) • QB contiene PCNA (otro factor de replicación) • ArFTcontiene > cantidad de proteínas. • ArEcontiene > de ac. nucleicos. Quitar pp > Tamaño <

  5. RESULTADOS Replicación nuclear in vitro FS Microscopia de fluorescencia. Células incubadas con las diferentes fracciones extraídas . Rojo: nucleos (yoduro de propidio) Verde: replicación del DNA (incorporación de digoxigenina-dUMP) Análisis cuantitativo de la replicación nuclear in Vitro

  6. Fracción ArE Pequeños RNAshY Visualización de RNA purificado de la fracción ArE

  7. Gel de Y RNA (peso molecular).

  8. Secuencias de nucleótidos de hY

  9. IDENTIFICACIÓN DE PEQUEÑOS RNAs PRESENTES • Se clonaron y secuenciaron. • 5S RNAr. • U2 RNAsn. • RNA hY 1- 5. • Se hicieron construcciones de RNAs

  10. Construcciones de todos los RNAs humanos Expresión de RNAs (gel de electroforesis) • Todos los RNAshY son específicamente requeridos para la replicación cromosomal del DNA en humanos (G1).

  11. RT-PCR en el extracto citosólico

  12. DEPLECIÓN DE LOS RNAshY, INHIBE LA REPLICACIÓN DEL DNA (in vitro)

  13. DEPLECIÓN DE LOS RNAshY, INHIBE LA REPLICACIÓN DEL DNA (in vitro) • Se trata a los RNAshY con RNAasa A . La replicación es restablecida agregando cualquier otro RNA hY sin degradar. • Se demuestra que los RNAshY pueden reemplazar funcionalmente a otro en este sistema.

  14. RNAs Y son requeridos para la reconstitución de la replicación de ADN semiconservativa

  15. LA UNIÓN DE RNA hY1 A LA PROTEÍNA Ro60 NO ES ESENCIAL PARA LA REPLICACIÓN DEL DNA Tres diferentes mutantes de RNA hY1. Se pierde su unión especifica pero no afecta el % de la replicación.

  16. LOS RNAs hY SON REQUERIDOS PARA LA REPLICACIÓN DEL DNA (in vivo) Se sintetizaron 2 RNAs de interferencia en El dominio del loop del RNA hY1. Expresión de RNA por RT-PCR

  17. Cuantificación de la replicación (S) en las células después de transfectar con los RNAs. •  Estos datos apoyan el papel de los RNAs HY para la replicación del ADN cromosómico en células humanas in vivo.

  18. CONCLUCIONES • 1.- Identifican un nuevo factor para la replicación del DNA cromosomal. • 2.- Si se degrada a los RNA hY se inhibe la replicación. • 3.- Una posible explicación de cómo los RNA hY son involucrados en la replicación del DNA cromosomal, es de que ellos podrían actuar directamente como primers para la síntesis de las hebras del DNA.

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