html5-img
1 / 45

KROMOSZÓMA SZINTŰ HIBÁK KIMUTATÁSA, MÓDSZEREK

KROMOSZÓMA SZINTŰ HIBÁK KIMUTATÁSA, MÓDSZEREK. Előadó: Dr. Kocsis Zsuzsanna Országos Kémiai Biztonsági Intézet Molekuláris és Sejtbiológiai Osztály Budapest, Nagyvárad tér 2. Helyszín: ELTE, 2012. 10. 27. Kompartmentalizáció Prokarióta sejtek Eukarióta sejtek.

Download Presentation

KROMOSZÓMA SZINTŰ HIBÁK KIMUTATÁSA, MÓDSZEREK

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. KROMOSZÓMA SZINTŰ HIBÁK KIMUTATÁSA, MÓDSZEREK Előadó: Dr. Kocsis Zsuzsanna Országos Kémiai Biztonsági Intézet Molekuláris és Sejtbiológiai Osztály Budapest, Nagyvárad tér 2. Helyszín: ELTE, 2012. 10. 27.

  2. Kompartmentalizáció Prokarióta sejtek Eukarióta sejtek Kromatinalapszerkezet: nukleoszóma * DNS kettős spirál és a hisztonok alkotják * Hisztonok: bázikus fehérjék (argininben és lizinben gazdag) * 5 osztályuk van: H1H1, H2A, H2B, H3 és H4 nukleoszomális hisztonok Hisztonkorong (oktamer): 8 hisztonmolekulából álló (2*4) 2 csavarulatban 146 bázispárnyi DNS tekeredik rá 2 korong között kb. 60 bp linkerrégió + H1 molekula A DNS kondenzációját a kondenzin foszforilációja indítja el. kohezin ATP-áz

  3. Kromoszóma morfológia Eukromatikusrégió: aktív géneket tartalmaz (génexpresszió, RNS szintézis) Heterokromatikusrégió: inaktív DNS szakaszok konstitutív heterokromatin (pl. centromer) fakultatív heteroktromatikus régió rövidkar centroméra hosszú kar testvérkromatidák

  4. Kromoszóma territórium Egy adott kromoszóma a sejtmag egy adott régiójában található. Szigorú sejtmagi rend.

  5. Humán lymphocyta kromoszóma preparátum Genom: a sejtmagban található összes genetikai információ. Kromoszóma: A genetikai információt tároló strukturális egység. Kromoszóma száma, morfológiája szervezettsége fajra jellemző és állandó. G-sávos normál női karyotípus

  6. Öregedés, rák, stabil kromoszóma • Telomer: • - kromoszóma vége • - rövid TTAGGG szakasz több ezerszeres mennyiségben (20-25 ezer bázispár) • genetikai óra, telomer rövidülés öregedés • 2009 orvosi Nobel Díj • - minden osztódáskor 100 bp rövidülés a DNS polimeráz enzim • működéséből adódóan • - egészséges sejtekben a telomeraz inaktív • - Az emberi sejt 50 osztódásra képes. • 50 osztódás után a sejt apoptózissal meghal. • Tumoros sejtekben a telomer szerepe: • a telomeráz enzim aktivitása magasabb • Azt gondolják, hogy a telomeráz enzim retrovírus eredetű. • Ivarsejtekben is!

  7. MITOZIS * * * A mitózis gondoskodik a szülői és az utódsejt azonos kromoszómakészletéről. A sejtosztódás S fázisában a kromoszómák anyaga megkettőződik. A mitózis kromoszóma számtartó osztódás.

  8. X-kromoszóma inaktiváció A nőstény emlősök sejtjeiben Az egyik X-kromoszóma inaktiválódik (random módon), XfXv . Az inaktivált X kondenzálódik - Barr-testecske. Bizonyos sejtek utódai együtt maradnak (sejtklónok). A nőstény emlősök teste mozaikos, vagyis olyan sejtek klónjainak a keveréke, amelyekben hol egyik, hol a másik X aktív. Heterozigótákon detektálhatók lehetnek a foltok. Vörös/fekete tarka macskák esete

  9. B IX. faktor A VIII. faktor Hemofilia Nemhez kötött recesszív megbetegedés

  10. KROMOSZÓMA ABERRÁCIÓ TÍPUSAI: Strukturális kromoszóma aberráció: deléció inszerció transzlokáció Numerikus kromoszóma aberráció: poliploidia aneuploidia

  11. Deléció kromoszóma szegmentek elvesztése Különböző humán betegségek delécióra vezethetőek vissza. A kis deléciók tolerálhatóak. A nagy deléciók nem tolerálhatóak, letalitáshoz vezetnek.

  12. Cri du chat – macskasírás szindróma • Az ember esetében a genom kiegyensúlyozatlanság miatt a legkisebb deléciók is komoly abnormalitást okoznak. • A macskasírás szindróma estében az 5. kromoszóma rövid (p) karjának vége hiányzik. • Mikroencefáliával, holdszerű arccal és szellemi elmaradottsággal jár. 4 év alatti halál. • születéskori gyakoriság: 1/50,000

  13. Rákos sejtek gyakran mutatnak deléciókat

  14. DUPLIKÁCIÓ: Kromoszóma szegmensek megkettőződése. Jó példa a duplikációra a Drosophila Bar mutációja.

  15. Az X kromoszóma 16A régiójának kópia száma különböző

  16. A gén duplikáció evolúciós szerepe Ha a gén fontos a szervezet számára nem változhat. De ha a génből több kópia van a képződő proteinek módosulhatnak és új funkciókat láthatnak el. Duplikációval keletkezett gén családok hasonló proteineket készítenek. Jó példa erre a globin gének, amelyekről α és β globin láncok szintetizálódnak, a hemoglobin szerkezeti alegységei.

  17. A gén duplikáció lehetőséget ad, a mutációs változásoknak, a funkciók divergálásának • Az emberi hemoglobin gén duplikációs változások eredménye. Különböző életkorokban különböző alegységek alakítják ki a működő hemoglobin molekulát. 3 hónapos korig az embrionális Hemg. Szülésig a magzati Hemg. 20-30% Szülés után 2α 2ß.

  18. Inverzió:Egy kromoszóma szakasz 180 fokos megfordulásának az eredménye. pericentrikus inverzió magába foglalja centromert paracentrikus inverzió a centromert nem érinti, csak a kromoszóma egyik v. másik karját Gén környezet, gén kapcsoltság, génátírás módosul.

  19. TRANSZLOKÁCIÓ: intrakromoszómális transzlokáció: Egy kromoszóma szakasz áthelyeződése ugyanabba a kromoszómába. interkromoszómális transzlokáció: Nem homológ kromoszómák közötti transzlokáció. Transzlokáció során nincs genetikai anyag vesztés. A gének pozíciója azonban megváltozik.

  20. Down szindróma: • 14 és 21-es kromoszóma közötti Robertson transzlokáció. • A 21-es krom. transzlokációja a 14-es krom.-ra eredményezi a familiáris Down syndromát.Örökölhető. • 21-es kromoszóma triszómia (Osztódási hiba) • Az anya életkorának előrehaladtával (40-45 év felett) az előfordulási gyakoriság exp. növekszik. Prenatális szűrés. • Születéskori gyakorisága nagy: • 1/500-1/700

  21. Myeloid leukémiaA 9-es és a 22-es kromoszómák közötti transzlokáció eredménye a “Philadelphia kromoszóma”Az esetek 90%-ban krónikus myeloid leukemiát okoz.

  22. Burkitt’s lymphomaAz esetek 90% esetén a 8-as és 14-es kromoszómák közötti transzlokáció következménye.Transzlokáció következtében kialakuló pozíció effektus hatására kialakuló onkogének, sejtosztódást, rák keletkezését okozhatják.

  23. Alternatív toxikológiai módszerek in vitro vizsgálatok • Ajánlott teszt rendszerek: • Egysejtűeken végzett tesztek • Rovartesztek • in vitro sejtkultúrákon végzett tesztek • in vivo mutagenitási tesztek • long term karcinogenitási állatkísérletek • humán epidemiológiai vizsgálatok Genotoxikus és daganatkeltő hatások vizsgálata • előnyei: • in vitro körülmények között sejteken (élő állat alkalmazása nélkül ) • rövid idejű • olcsóbb • reprodukálható • nem használ élő állatot • Az esetleges hatás megállapításához több, különböző módszerrel végzett vizsgálat • egybehangzó eredményére van szükség.

  24. Bevezetés A BIZOTTSÁG 440/2008/EK RENDELETE a vegyi anyagok regisztrálásáról,értékeléséről,engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH) szóló a 1907/2006/EK európai parlamenti és tanácsi rendelet értelmében alkalmazandó vizsgálati módszerek megállapításáról. B.rész.:Módszerek a toxicitás és egyéb egészségügyi hatások meghatározására B.10. Mutagenitás-Kromoszóma-Rendellenesség in vitro vizsgálata emlősökön OECD 473 TG OECD 487 TG in vitro mikronukleusz vizsgálat emlős sejteken B.13/14. Mutagenitás: Reverz mutagenitási vizsgálat baktériumokkal OECD 471 TG B.18. DNS károsodás és –reparáció-nem tervezett DNS-szintészis (unscheduled DNA Synthesis, UDS) –emlős sejteken in vitro OECD 476 TG B.19. In vitro emlőssejt testvér-kromatid kicserélődés (sister chromatid exchange , SCE) vizsgálat OECD 479 TG B. 20. Nemhez kötött recesszív letális vizsgálat Drosophila melanogasteren OECD 477 TG

  25. Azonos szakmai szabályok GLP= Good Laboratory Practice (Helyes Laboratóriumi Gyakorlat) ISO= International Organization for Standardization (Nemzetközi Szabványügyi Szervezet) Vizsgálati irányelvek OECD= Organisation for Economical Cooperation and Development (Gazdasági es Fejlesztési Együttműködési Szervezet) Kromoszóma aberráció in vitro vizsgálata emlős sejteken OECD TG 473 vizsgálati irányelv szerint Célja: azon kémiai anyagok meghatározása, amelyek kromoszóma károsodást okoznak emlős sejtekben.

  26. A kromoszóma aberráció vizsgálat ismertetése • Sejtek • Alkalmazható sejtvonalak jellemzői: • stabil permanens v. primer sejtkultúrák (pl. CHO, humán lymfocita) • jó növekedési képesség, rövid generációs idő, • kariotípus stabilitás, állandó krom. szám. • Kromoszómák alaki változatossága és stabilitása. • kínai hörcsög ovárium fibroblaszt sejt (CHO, Puck1957) • Tápfolyadékok, tenyésztési körülmények • Mesterséges tápfolyadékok elterjedése (Ham’s F12). • Sejtvonalak ellenőrzése: • Kariogram • Kromoszóma szám • Mikoplazma • Spontán kromoszóma aberráció gyakoriság • Történeti kontroll

  27. Vizsgálati anyag előkészítése: • kémiai összetétel, szennyeződés, stabilitás • oldószer kiválasztása • hígítási sor készítése • stabilitás vizsgálat • archiválás • Elő-kísérlet: • citotoxicitási vizsgálat MTT-assay (mitokondriális szukcinát-dehidrogenáz enzim) • mitotikus index meghatározása • MI: A metafázisban lévő sejtek és a sejtpopuláció összes sejtjének aránya. • A sejtpopuláció proliferációjának a mértékét jellemzi. • Koncentráció • Legkevesebb három elemezhető koncentráció. • Citotoxikus anyag esetén: va. az a koncentrációja amely a festék-redukciót 50%-kal csökkenti. • Nem citotoxikus anyag esetén: va. 5 mg/ml v. 0,01M

  28. Direkt-és indirekt-mutagén anyagok • Metabolikus aktiválás: • S9 alkalmazása • rágcsálók enziminducerrel (Arochlor 1254, v. fenobarbiturát és β-naftoflavon) kezelt májából előállított poszmitokondriális frakció (S9) • kofaktorokkal kiegészítve • (ADPH, glukóz-6-foszfát). • S9 végkoncentráció 5-10% közötti. • citokróm P450 enzim aktiválása. • Indirekt mutagének kimutatására alkalmas

  29. Kontrollok: • Metabolikus aktiválás nélkül: MMS, EMS, Mitomycin-C • Metabolikus aktiválással: CP, Benz(a)pirén • Oldószer: tápfolyadék, DMSO • Archiválás • Kezelési idők: • 4 óra +S9 • 4 óra -S9 ÉRTÉKELÉS • pozitív Negatív • ismétlés 24 óra -S9 • 48 óra -S9

  30. Kolhicinezés: • Célja a metafázisos kromoszómák összegyűjtése • Őszi kikerics (Colchicum autumnale) hagymájából készült kivonat. • Köszvény gyógyítására alkalmazták. A kolhicin sejtosztódás gátló, a mitózis metafázisában. • Normál esetben a sejtek 2-5%-a osztódik, néhány órás kolhicinezés összegyűjti a sejteket a metafázisban, akár 40-50 százalékuk is blokkolt metafázisban található. • A kolhicin a magorsó mikrotubulusaihoz kötődik.

  31. Kromoszóma preparátum • Fénymikroszkópos értékelés • kromatid típusú aberrációk:kromoszóma típusú aberrációk: • deléció deléció • exchange exchange

  32. CHO sejt, kezeletlen kontroll. Felvétel: OKBI. MSBO. 2010.

  33. CHO sejt, Deléció. Felvétel OKBI. MSBO. 2000.

  34. CHO sejt. Deléció. Felvétel: OKBI. MSBO 2000.

  35. Humán limfocita. Kezeletlen kontroll. Felvétel: OKBI. MSBO. 2000.

  36. A környezeti arzén-expozíció egészségkárosító hatásai • Arzénmérgezés” • Teratogenitás; neurotoxikus hatás • Citotoxikus hatás (immuntoxicitás?) • Hormon diszruptor hatás • Glukokortikoid receptor gátlás • Ösztrogén receptor gátlás • Daganatkeltő hatás • Géntoxicitás (oxidatív stressz) • Repair gátlás (ligáz gátlás) • Epigenetikus hatás (metiláció) Növekvő dózis

  37. Kromoszóma aberráció vizsgálat in vitro emlős sejteken OECD TG 473 Kromoszóma aberráció Normál metafázis Fragmentált kromoszómák Endomitózis CHO-K1 (ATCC-CCL-61; Chinese hamster) Kínai hörcsög ovárium fibroblaszt Felvételek készültek: OKBI 2011 Molekuláris és Sejtbiológiai Osztály

  38. B.19. IN VITRO EMLŐSSEJT TESTVÉR – KROMATID KICSERÉLŐDÉS (SISTER CHROMATID EXCHANGE , SCE) VIZSGÁLAT OECD TG 479 A testi sejtek kromoszómáiban a testvér-kromatidák közötti kicserélődés, reciprok DNS csere. Láthatóvá tehető, ha két sejtcikluson át bróm-dezoxi-uridinnel (timidin-analóg) jelöljük. Hoechst festés, majd UV kezelés, klasszikus Giemsa festés. Az SCE nem kromoszómaaberráció (Ctr. SCE 5). Az SCE már olyan kis vegyi mutagén-karcinogén expozíció kiváltja, amelyik még nem okoz krom. aberrációt. Alkalmazása primer prevencióban.

  39. Az SCE indukcióban a repair folyamatok részvétele valószínű. A DNS repair deficiens congenitális defektusok esetében fokozott SCE indukáltság figyelhető meg az egészséges kontrollokhoz képest. pl.: Bloom szindróma Fanconi-anémia Werner sindróma xeroderma pigmentosum ataxia telangiectasia Dow kór

  40. Ataxia telangiectasia (ATM) Rendkívül sokféle, sok szervet érintő tünet együttes sugár érzékenység és tumorok kialakulása

  41. Bloom szindróma Kromoszóma instabilitás jellemzi • Örökletes betegség, családi halmozódás 15q26.1, a BLM gén mutációja. • Fokozott sister chromatid exchange (SCE) és spontán kromoszóma törékenység. • DNS repair enzimek károsodása • Jelentős mutagén túlérzékenység. • a magasabb daganatképződési kockázat normál sejt Bloom szindromás beteg sejt

  42. In vitro mikronukleusz teszt OECD TG 487 Kromoszóma aberráció kimutatására alkalmas Kb 80% egyezés a kromoszóma aberráció teszttel, olcsóbb, gyorsabb Mikronukleusz: a sejtmagnál kisebb méretű, membránhatárolt DNS darabok, amelyek a citoplazmában jelennek meg a sejtosztódás zavara esetén mikronukleusz apoptózis

  43. A nemhez kötött recesszív mutagenitási vizsgálat (Müller-5 teszt) elvi vázlata OECD TG B. 18. Nem-tervezett DNS-szintézis (UDS) in vitro vizsgálata emlős májsejteken OECD TG 482 patkány primer májsejt Jelölések: * = sárga testszínű kerek, piros szemű hím kék = kezeletlen X kromoszóma piros = kezelt X kromoszóma nyíl = Y kromoszóma Molinát és Vernolát gyomírtók repair-szintézist idukáló hatása primer patkánymájsejtben Egészségtudomány: 36,187-192 (1992) Kinoxalin származékok vizsgálata Népegészségügy 90 (1) 45-52 (2012) A vizsgálatokat az OKBI molekuláris és Sejtbiológiai Osztályán végezték.

  44. Köszönöm a figyelmet 2012 ELTE 11.27.

More Related