kromosz ma szint hib k kimutat sa m dszerek n.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
KROMOSZÓMA SZINTŰ HIBÁK KIMUTATÁSA, MÓDSZEREK PowerPoint Presentation
Download Presentation
KROMOSZÓMA SZINTŰ HIBÁK KIMUTATÁSA, MÓDSZEREK

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 45

KROMOSZÓMA SZINTŰ HIBÁK KIMUTATÁSA, MÓDSZEREK - PowerPoint PPT Presentation


  • 151 Views
  • Uploaded on

KROMOSZÓMA SZINTŰ HIBÁK KIMUTATÁSA, MÓDSZEREK. Előadó: Dr. Kocsis Zsuzsanna Országos Kémiai Biztonsági Intézet Molekuláris és Sejtbiológiai Osztály Budapest, Nagyvárad tér 2. Helyszín: ELTE, 2012. 10. 27. Kompartmentalizáció Prokarióta sejtek Eukarióta sejtek.

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'KROMOSZÓMA SZINTŰ HIBÁK KIMUTATÁSA, MÓDSZEREK' - frances-woods


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
kromosz ma szint hib k kimutat sa m dszerek

KROMOSZÓMA SZINTŰ HIBÁK KIMUTATÁSA, MÓDSZEREK

Előadó: Dr. Kocsis Zsuzsanna

Országos Kémiai Biztonsági Intézet

Molekuláris és Sejtbiológiai Osztály

Budapest, Nagyvárad tér 2.

Helyszín: ELTE, 2012. 10. 27.

slide2

Kompartmentalizáció

Prokarióta sejtek

Eukarióta sejtek

Kromatinalapszerkezet: nukleoszóma

* DNS kettős spirál és a hisztonok alkotják

* Hisztonok: bázikus fehérjék

(argininben és lizinben gazdag)

* 5 osztályuk van: H1H1, H2A, H2B, H3 és H4

nukleoszomális hisztonok

Hisztonkorong (oktamer):

8 hisztonmolekulából álló (2*4)

2 csavarulatban

146 bázispárnyi DNS tekeredik rá

2 korong között kb. 60 bp linkerrégió + H1 molekula

A DNS kondenzációját

a kondenzin foszforilációja

indítja el.

kohezin ATP-áz

slide3

Kromoszóma morfológia

Eukromatikusrégió:

aktív géneket tartalmaz (génexpresszió, RNS szintézis)

Heterokromatikusrégió:

inaktív DNS szakaszok

konstitutív heterokromatin (pl. centromer)

fakultatív heteroktromatikus régió

rövidkar

centroméra

hosszú kar

testvérkromatidák

slide4

Kromoszóma territórium

Egy adott kromoszóma a sejtmag

egy adott régiójában található.

Szigorú sejtmagi rend.

slide5

Humán lymphocyta kromoszóma preparátum

Genom: a sejtmagban található összes genetikai információ.

Kromoszóma: A genetikai információt tároló strukturális egység.

Kromoszóma száma, morfológiája szervezettsége fajra jellemző és állandó.

G-sávos normál női karyotípus

slide6

Öregedés, rák, stabil kromoszóma

  • Telomer:
  • - kromoszóma vége
  • - rövid TTAGGG szakasz több ezerszeres mennyiségben (20-25 ezer bázispár)
  • genetikai óra, telomer rövidülés öregedés
  • 2009 orvosi Nobel Díj
  • - minden osztódáskor 100 bp rövidülés a DNS polimeráz enzim
  • működéséből adódóan
  • - egészséges sejtekben a telomeraz inaktív
  • - Az emberi sejt 50 osztódásra képes.
  • 50 osztódás után a sejt apoptózissal meghal.
  • Tumoros sejtekben a telomer szerepe:
  • a telomeráz enzim aktivitása magasabb
  • Azt gondolják, hogy a telomeráz enzim retrovírus eredetű.
  • Ivarsejtekben is!
slide7

MITOZIS

*

*

*

A mitózis gondoskodik a szülői és az utódsejt azonos kromoszómakészletéről. A sejtosztódás S fázisában a kromoszómák anyaga megkettőződik. A mitózis kromoszóma számtartó osztódás.

slide9

X-kromoszóma inaktiváció

A nőstény emlősök sejtjeiben

Az egyik X-kromoszóma inaktiválódik (random módon), XfXv .

Az inaktivált X kondenzálódik - Barr-testecske.

Bizonyos sejtek utódai együtt maradnak (sejtklónok).

A nőstény emlősök teste mozaikos, vagyis olyan sejtek

klónjainak a keveréke, amelyekben hol egyik, hol a másik X aktív.

Heterozigótákon

detektálhatók lehetnek a foltok.

Vörös/fekete tarka macskák esete

slide10

B

IX. faktor

A

VIII. faktor

Hemofilia

Nemhez kötött recesszív megbetegedés

slide11

KROMOSZÓMA ABERRÁCIÓ TÍPUSAI:

Strukturális kromoszóma aberráció:

deléció

inszerció

transzlokáció

Numerikus kromoszóma aberráció:

poliploidia

aneuploidia

slide12

Deléció

kromoszóma szegmentek elvesztése

Különböző humán betegségek delécióra vezethetőek vissza.

A kis deléciók tolerálhatóak.

A nagy deléciók nem tolerálhatóak, letalitáshoz vezetnek.

cri du chat macskas r s szindr ma
Cri du chat – macskasírás szindróma
  • Az ember esetében a genom kiegyensúlyozatlanság miatt a legkisebb deléciók is komoly abnormalitást okoznak.
  • A macskasírás szindróma estében az 5. kromoszóma rövid (p) karjának vége hiányzik.
  • Mikroencefáliával, holdszerű arccal és szellemi elmaradottsággal jár. 4 év alatti halál.
  • születéskori gyakoriság:

1/50,000

slide15

DUPLIKÁCIÓ:

Kromoszóma szegmensek megkettőződése.

Jó példa a duplikációra a Drosophila Bar mutációja.

slide17

A gén duplikáció evolúciós szerepe

Ha a gén fontos a szervezet számára nem változhat.

De ha a génből több kópia van a képződő proteinek

módosulhatnak és új funkciókat láthatnak el.

Duplikációval keletkezett gén családok

hasonló proteineket készítenek.

Jó példa erre a globin gének,

amelyekről α és β globin láncok szintetizálódnak,

a hemoglobin szerkezeti alegységei.

a g n duplik ci lehet s get ad a mut ci s v ltoz soknak a funkci k diverg l s nak
A gén duplikáció lehetőséget ad, a mutációs változásoknak, a funkciók divergálásának
  • Az emberi hemoglobin gén duplikációs változások eredménye. Különböző életkorokban különböző alegységek alakítják ki a működő hemoglobin molekulát.

3 hónapos korig az embrionális Hemg.

Szülésig a magzati Hemg. 20-30%

Szülés után 2α 2ß.

slide19

Inverzió:Egy kromoszóma szakasz 180 fokos megfordulásának

az eredménye.

pericentrikus inverzió magába foglalja centromert

paracentrikus inverzió a centromert nem érinti,

csak a kromoszóma egyik v. másik karját

Gén környezet, gén kapcsoltság, génátírás módosul.

slide20

TRANSZLOKÁCIÓ:

intrakromoszómális transzlokáció:

Egy kromoszóma szakasz áthelyeződése

ugyanabba a kromoszómába.

interkromoszómális transzlokáció:

Nem homológ kromoszómák

közötti transzlokáció.

Transzlokáció során nincs genetikai anyag vesztés.

A gének pozíciója azonban megváltozik.

slide21

Down szindróma:

  • 14 és 21-es kromoszóma közötti Robertson transzlokáció.
  • A 21-es krom. transzlokációja a 14-es krom.-ra eredményezi a familiáris Down syndromát.Örökölhető.
  • 21-es kromoszóma triszómia (Osztódási hiba)
  • Az anya életkorának előrehaladtával (40-45 év felett) az előfordulási gyakoriság exp. növekszik. Prenatális szűrés.
  • Születéskori gyakorisága nagy:
  • 1/500-1/700
slide22

Myeloid leukémiaA 9-es és a 22-es kromoszómák közötti transzlokáció eredménye a “Philadelphia kromoszóma”Az esetek 90%-ban krónikus myeloid leukemiát okoz.

slide23

Burkitt’s lymphomaAz esetek 90% esetén a 8-as és 14-es kromoszómák közötti transzlokáció következménye.Transzlokáció következtében kialakuló pozíció effektus hatására kialakuló onkogének, sejtosztódást, rák keletkezését okozhatják.

slide24

Alternatív toxikológiai módszerek

in vitro vizsgálatok

  • Ajánlott teszt rendszerek:
  • Egysejtűeken végzett tesztek
  • Rovartesztek
  • in vitro sejtkultúrákon végzett tesztek
  • in vivo mutagenitási tesztek
  • long term karcinogenitási állatkísérletek
  • humán epidemiológiai vizsgálatok

Genotoxikus és daganatkeltő hatások vizsgálata

  • előnyei:
  • in vitro körülmények között sejteken (élő állat alkalmazása nélkül )
  • rövid idejű
  • olcsóbb
  • reprodukálható
  • nem használ élő állatot
  • Az esetleges hatás megállapításához több, különböző módszerrel végzett vizsgálat
  • egybehangzó eredményére van szükség.
slide25

Bevezetés

A BIZOTTSÁG 440/2008/EK RENDELETE

a vegyi anyagok regisztrálásáról,értékeléséről,engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH) szóló

a 1907/2006/EK európai parlamenti és tanácsi rendelet értelmében alkalmazandó vizsgálati módszerek megállapításáról.

B.rész.:Módszerek a toxicitás és egyéb egészségügyi hatások meghatározására

B.10. Mutagenitás-Kromoszóma-Rendellenesség in vitro vizsgálata emlősökön

OECD 473 TG

OECD 487 TG in vitro mikronukleusz vizsgálat emlős sejteken

B.13/14. Mutagenitás: Reverz mutagenitási vizsgálat baktériumokkal

OECD 471 TG

B.18. DNS károsodás és –reparáció-nem tervezett DNS-szintészis (unscheduled DNA Synthesis, UDS) –emlős sejteken in vitro

OECD 476 TG

B.19. In vitro emlőssejt testvér-kromatid kicserélődés

(sister chromatid exchange , SCE) vizsgálat

OECD 479 TG

B. 20. Nemhez kötött recesszív letális vizsgálat Drosophila melanogasteren

OECD 477 TG

slide26

Azonos szakmai szabályok

GLP= Good Laboratory Practice

(Helyes Laboratóriumi Gyakorlat)

ISO= International Organization for Standardization

(Nemzetközi Szabványügyi Szervezet)

Vizsgálati irányelvek

OECD= Organisation for Economical Cooperation and Development

(Gazdasági es Fejlesztési Együttműködési Szervezet)

Kromoszóma aberráció in vitro vizsgálata emlős sejteken

OECD TG 473 vizsgálati irányelv szerint

Célja: azon kémiai anyagok meghatározása, amelyek kromoszóma károsodást

okoznak emlős sejtekben.

slide27

A kromoszóma aberráció vizsgálat ismertetése

  • Sejtek
  • Alkalmazható sejtvonalak jellemzői:
  • stabil permanens v. primer sejtkultúrák (pl. CHO, humán lymfocita)
  • jó növekedési képesség, rövid generációs idő,
  • kariotípus stabilitás, állandó krom. szám.
  • Kromoszómák alaki változatossága és stabilitása.
  • kínai hörcsög ovárium fibroblaszt sejt (CHO, Puck1957)
  • Tápfolyadékok, tenyésztési körülmények
  • Mesterséges tápfolyadékok elterjedése (Ham’s F12).
  • Sejtvonalak ellenőrzése:
  • Kariogram
  • Kromoszóma szám
  • Mikoplazma
  • Spontán kromoszóma aberráció gyakoriság
  • Történeti kontroll
slide28

Vizsgálati anyag előkészítése:

  • kémiai összetétel, szennyeződés, stabilitás
  • oldószer kiválasztása
  • hígítási sor készítése
  • stabilitás vizsgálat
  • archiválás
  • Elő-kísérlet:
  • citotoxicitási vizsgálat

MTT-assay (mitokondriális szukcinát-dehidrogenáz enzim)

  • mitotikus index meghatározása
  • MI: A metafázisban lévő sejtek és a sejtpopuláció összes sejtjének aránya.
  • A sejtpopuláció proliferációjának a mértékét jellemzi.
  • Koncentráció
  • Legkevesebb három elemezhető koncentráció.
  • Citotoxikus anyag esetén: va. az a koncentrációja amely a festék-redukciót 50%-kal csökkenti.
  • Nem citotoxikus anyag esetén: va. 5 mg/ml v. 0,01M
slide29

Direkt-és indirekt-mutagén anyagok

  • Metabolikus aktiválás:
  • S9 alkalmazása
  • rágcsálók enziminducerrel (Arochlor 1254, v. fenobarbiturát és β-naftoflavon) kezelt májából előállított poszmitokondriális frakció (S9)
  • kofaktorokkal kiegészítve
  • (ADPH, glukóz-6-foszfát).
  • S9 végkoncentráció 5-10% közötti.
  • citokróm P450 enzim aktiválása.
  • Indirekt mutagének kimutatására alkalmas
slide30

Kontrollok:

  • Metabolikus aktiválás nélkül: MMS, EMS, Mitomycin-C
  • Metabolikus aktiválással: CP, Benz(a)pirén
  • Oldószer: tápfolyadék, DMSO
  • Archiválás
  • Kezelési idők:
  • 4 óra +S9
  • 4 óra -S9 ÉRTÉKELÉS
  • pozitív Negatív
  • ismétlés 24 óra -S9
  • 48 óra -S9
slide31

Kolhicinezés:

  • Célja a metafázisos kromoszómák összegyűjtése
  • Őszi kikerics (Colchicum autumnale) hagymájából készült kivonat.
  • Köszvény gyógyítására alkalmazták. A kolhicin sejtosztódás gátló, a mitózis metafázisában.
  • Normál esetben a sejtek 2-5%-a osztódik, néhány órás kolhicinezés összegyűjti a sejteket a metafázisban, akár 40-50 százalékuk is blokkolt metafázisban található.
  • A kolhicin a magorsó mikrotubulusaihoz kötődik.
slide32

Kromoszóma preparátum

        • Fénymikroszkópos értékelés
  • kromatid típusú aberrációk:kromoszóma típusú aberrációk:
  • deléció deléció
  • exchange exchange
slide37

A környezeti arzén-expozíció egészségkárosító hatásai

  • Arzénmérgezés”
  • Teratogenitás; neurotoxikus hatás
  • Citotoxikus hatás (immuntoxicitás?)
  • Hormon diszruptor hatás
    • Glukokortikoid receptor gátlás
    • Ösztrogén receptor gátlás
  • Daganatkeltő hatás
    • Géntoxicitás (oxidatív stressz)
    • Repair gátlás (ligáz gátlás)
    • Epigenetikus hatás (metiláció)

Növekvő dózis

slide38

Kromoszóma aberráció vizsgálat in vitro emlős sejteken

OECD TG 473

Kromoszóma aberráció

Normál metafázis

Fragmentált kromoszómák

Endomitózis

CHO-K1 (ATCC-CCL-61; Chinese hamster)

Kínai hörcsög ovárium fibroblaszt

Felvételek készültek: OKBI 2011

Molekuláris és Sejtbiológiai Osztály

slide39

B.19. IN VITRO EMLŐSSEJT TESTVÉR – KROMATID KICSERÉLŐDÉS

(SISTER CHROMATID EXCHANGE , SCE) VIZSGÁLAT

OECD TG 479

A testi sejtek kromoszómáiban a testvér-kromatidák közötti kicserélődés,

reciprok DNS csere.

Láthatóvá tehető, ha két sejtcikluson át bróm-dezoxi-uridinnel (timidin-analóg) jelöljük.

Hoechst festés, majd UV kezelés, klasszikus Giemsa festés.

Az SCE nem kromoszómaaberráció (Ctr. SCE 5).

Az SCE már olyan kis vegyi mutagén-karcinogén expozíció kiváltja, amelyik még

nem okoz krom. aberrációt.

Alkalmazása primer prevencióban.

slide40

Az SCE indukcióban a repair folyamatok részvétele valószínű.

A DNS repair deficiens congenitális defektusok esetében fokozott SCE indukáltság figyelhető meg az egészséges kontrollokhoz képest. pl.:

Bloom szindróma

Fanconi-anémia

Werner sindróma

xeroderma pigmentosum

ataxia telangiectasia

Dow kór

slide41

Ataxia telangiectasia (ATM)

Rendkívül sokféle, sok szervet

érintő tünet együttes

sugár érzékenység

és tumorok kialakulása

bloom szindr ma kromosz ma instabilit s jellemzi
Bloom szindróma Kromoszóma instabilitás jellemzi
  • Örökletes betegség, családi halmozódás

15q26.1, a BLM gén mutációja.

  • Fokozott sister chromatid exchange (SCE) és spontán kromoszóma törékenység.
  • DNS repair enzimek károsodása
  • Jelentős mutagén túlérzékenység.
  • a magasabb daganatképződési kockázat

normál sejt

Bloom szindromás beteg sejt

slide43

In vitro mikronukleusz teszt

OECD TG 487

Kromoszóma aberráció kimutatására alkalmas

Kb 80% egyezés a kromoszóma aberráció teszttel, olcsóbb, gyorsabb

Mikronukleusz: a sejtmagnál kisebb méretű, membránhatárolt DNS darabok, amelyek a citoplazmában jelennek meg a sejtosztódás zavara esetén

mikronukleusz

apoptózis

slide44

A nemhez kötött recesszív mutagenitási vizsgálat

(Müller-5 teszt) elvi vázlata

OECD TG

B. 18. Nem-tervezett DNS-szintézis (UDS) in vitro vizsgálata emlős májsejteken OECD TG 482

patkány primer májsejt

Jelölések:

* = sárga testszínű kerek, piros szemű hím

kék = kezeletlen X kromoszóma

piros = kezelt X kromoszóma

nyíl = Y kromoszóma

Molinát és Vernolát gyomírtók repair-szintézist

idukáló hatása primer patkánymájsejtben

Egészségtudomány: 36,187-192 (1992)

Kinoxalin származékok vizsgálata

Népegészségügy 90 (1) 45-52 (2012)

A vizsgálatokat az OKBI molekuláris és Sejtbiológiai Osztályán végezték.