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植物病毒 RNA 沉默抑制因子的研究进展. 报告人：赵淑玲 导 师：梁建生教授. RNA 沉默的定义. 生物学现象来定义：. 生物学现象来定义：. 生物学现象来定义：. RNA 沉默是指由双链 RNA （ dsRNA ）诱发的同源 mRNA 高效特异性降解的现象。. RNA 沉默是指由双链 RNA （ dsRNA ）诱发的同源 mRNA 高效特异性降解的现象。. RNA 沉默是指由双链 RNA （ dsRNA ）诱发的同源 mRNA 高效特异性降解的现象。. 生物技术来定义：. 生物技术来定义：. 生物技术来定义：.
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植物病毒RNA沉默抑制因子的研究进展 报告人：赵淑玲 导 师：梁建生教授
RNA沉默的定义 生物学现象来定义： 生物学现象来定义： 生物学现象来定义： RNA沉默是指由双链RNA（dsRNA）诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。 RNA沉默是指由双链RNA（dsRNA）诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。 RNA沉默是指由双链RNA（dsRNA）诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。 生物技术来定义： 生物技术来定义： 生物技术来定义： 人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的。 人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的。 人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的。
基因沉默现象的发现 • 1990年，Jorgensen等将产生色素的基因导入矮牵牛中，试图加深花朵的颜色，结果很多花没有变成深紫色，反而成了花斑的甚至白的。表明不仅导入的基因未表达，而且本身同源的基因失活。从而发现在转基因植物中存在基因表达的共抑制现象，即转入的外源基因和本身的同源基因都被抑制，出现基因沉默现象。
父本 转基因后代 图1. GUS基因导入矮牵牛后的转基因植株
1998年Fire等证实，将制备的RNA高度纯化后发现，单链RNA的基因抑制作用很微弱，而用纯化后的dsRNA却能高效、特异地阻断相应基因的表达。实验证明双链RNA抑制基因的表达的效率比纯化后的反义RNA至少高几个数量 ，他们称此现象为dsRNA介导的RNA干扰（RNAi）
dsRNA dsRNA dsRNA dsRNA dsRNA inject inject inject inject Antisence RNA Negative control uninjected dsRNA 图2. 原位杂交法检测不同RNA导入后线虫Mex-3基因产物的表达
RNA沉默的作用机制 dsRNA在Dicer酶的作用下，被切割加工成21~25nt的双链siRNA siRNA 结合一个酶复合物形成RISC 激活的RISC将siRNA的双链解开，并通过碱基互补配对识别互补的mRNA，然后切割靶mRNA。
植物病毒编码的沉默抑制因子 • RNA沉默抑制子的发现 1997年，马铃薯X病毒属与马铃薯Y 病毒属间的协同效应的研究发现马铃薯X病毒属编码的HC-Pro蛋白在协生中起致病增强的作用，HC-Pro蛋白可能充当RNA沉默的抑制子。1998年，三个独立的小组采用不同的方法证实了这一推测。
RNA沉默抑制子的作用机理 • 主要的三种作用方式 • 抑制病毒siRNA的产生 • 阻碍siRNA整合入 RISC • 干扰RISC降解同源的mRNA
P19阻碍siRNA 整合入RISC P19阻碍siRNA 整合入RISC CMV 2b干扰信号的长距离移动 CMV 2b干扰信号的长距离移动 HC-Pro抑制RISC形成来抑制沉默 HC-Pro抑制RISC形成来抑制沉默 病毒沉默抑制子在siRNA和miRNA途径的作用目标
马铃薯Y病毒属编码的蛋白HC-Pro • HC-Pro 可能抑制RISC形成 HC-Pro干扰siRNA的积累，在共浸润实验中减少了21nt和24nt siRNA的积累。转HC-Pro基因的植物中内源mRNA的积累增加，说明HC-Pro影响miRNA的功能和生物合成。因此，HC-Pro可能干扰了miRNA 和siRNA调控的一个共同反应，即抑制RISC的形成。
番茄丛矮病毒属编码的P19 • P19 阻碍siRNA整合入RISC P19可结合siRNA双体，病毒侵染的植物中，病毒siRNA主要存在于P19复合体。 P19可能通过结合siRNA，使其不能整合入RISC来达到病毒侵染的目的。 并且P19抑制RNA沉默与蛋白质的积累量有关。
黄瓜花叶病毒属编码的2b蛋白 • CMV 2b干扰沉默信号的长距离移动 转基因植物的杂交和嫁接试验表明， CMV 2b蛋白只能抑制系统沉默，推测其可能干扰信号的长距离移动。CMV 2b定位于核内，含一个核定位信号（NLS），而RNA沉默过程中目标mRNA的降解在细胞质内，因而2b可能与内源因子互作，影响系统沉默信号的多个过程。
沉默抑制子的主要鉴定方法 基因沉默的回复 用携带待鉴定基因的病毒载体接种报告基因已经发生沉默的转基因植物，观察病毒载体引起的症状是否加重和报告基因能否回复表达。 接种带有待鉴定基因的病毒载体 接种带有待鉴定基因的病毒载体 接种带有待鉴定基因的病毒载体 GFP系统沉默 农杆菌浸润 农杆菌浸润 农杆菌浸润 农杆菌浸润 农杆菌浸润 农杆菌浸润
A B C D A. GFP在烟草中大量表达；B.携带嵌入GFP的双向质粒的农杆菌诱导的GFP基因沉默；C. PVY感染GFP发生沉默的烟草；D. 带有PVY HC-Pro基因的PVX病毒载体感染GFP发生沉默的烟草。紫外灯下观察GFP为绿色荧光
农杆菌共浸润瞬时抑制试验 构建分别含有报告基因和抑制子基因的两种农杆菌质粒后将含有两种这两种质粒的农杆菌混合注射植物叶片上，再跟踪观察注射区域的报告基因的表达情况。如果候选基因具有抑制子活性，报告基因的表达会持续很长时间，反之报告基因很快被沉默。此方法快速、简单，已被普遍应用，可用来快速、大量地筛选抑制子。 HC-Pro CMV 2b RGDV Pns11 空载体 RGDV Pns11抑制局部GFP沉默 带有35S-GFP的农杆菌与带有相应质粒的农杆菌混合后共渗透接种转基因本生烟16c，接种6天后在长波紫外灯下观察GFP荧光。
转基因植物的杂交和嫁接试验 方法： 利用这种方法首先要获得稳定表达待鉴定病毒基因和报告基因已经发生沉默的转基因植物，然后将两种植物进行杂交，在杂交后代观察报告基因能否回复表达。将转基因植物的杂交和嫁接试验结合，可以用来研究抑制子在系统沉默中的作用。 • 优缺点： • 耗时长，一般在其他方法初步鉴定的前提下再稳定转化抑制子 • 不受农杆菌、病毒载体等干扰，结果可靠，并可以用来抑制子的作用机理
T4 x TEV-B T4为GUS基因已经发生沉默的烟草; NT为非转基因的烟草;TEV-B为已经转入TEV P1的烟草; TEV-K为转入TEV P1发生突变的烟草; GUS基因产生的蛋白经染色后为蓝色 T4 x NT T4 x TEV-K 转基因植物杂交方法鉴定基因沉默抑制子
功能互补法 利用有抑制功能的抑制子来代替候选抑制子的一种方法。如，BSMV的b蛋白去除后病毒致病力下降，检测表明由RNA沉默引起。但这个突变株在转PVA的HC-Pro基因的植株内表现很强的致病力。并且用HC-Pro 替换b基因的重组病毒也能引起很强的致病力，同时RNA沉默的标志物siRNA也消失了。因此推测b可能与HC-Pro一样具有RNA沉默的功能。
沉默抑制子的应用 • 增强外源蛋白的表达 • 解析RNA沉默作用过程 • 抗病毒植物的研究
展 望 • 病毒与宿主间相互作用 病毒与植物宿主之间的相互作用呈现复杂性，抑制子的研究使人们对植物与病毒的互作将更深的认识，这将为探讨植物抗病毒的防治策略提供更直接的理论依据 • 抑制子对植物发育调控的影响 有些病毒编码的抑制子干扰miRNA介导的发育调控，然而大多数抑制子是否干扰植物的发育不得而知。 • 与抑制子蛋白互作的寄主因子 鉴定与抑制子蛋白互作的寄主因子对于了解RNA沉默的作用途径和机理都有重要意义。
