Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul

1. Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 1 Proč vibrační spektroskopie ? • strukturní informaci lze získat v relativně krátkém čase (proto nachází využití například v proteomice) • neomezuje se pouze na statický obrázek(citlivost ke změnám, možnost dynamických studií) • velikost studovaných molekul a povaha okolního prostředí nepředstavují žádné omezení (a nebo jen výjimečně) • je to mimořádně vhodná metoda pro zkoumání vztahu mezi strukturouafunkcí biomolekul

2. Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 2 Výhody vibračníspektroskopie • RS a IČ jsou nedestruktivní metody(možnost testování biologické aktivity po skončení měření). • Aplikovatelné na vzorky libovolné morfologie (roztoky vodné i nevodné, suspenze, precipitáty, gely, vrstvy, vlákna, prášky, monokrystaly, …). Pro biomolekuly lze tak ověřit nakolik se shoduje či naopak odlišuje jejich struktura v krystalu a v roztoku. • Nenáročné na objem vzorku (cca 10mlpro konvenční RS, 20mlpro IČ). • Rychlá časová škála absorpce i rozptylu ( 10-15 s) využití vibrační spektroskopie pro časově rozlišené studie procesů, které nejsou přístupné pomocí fluorescence či NMR. • Existence rozsáhlé databáze IČ a Ramanových spekter (včetně přiřazení pásů jednotlivým vibracím a známých strukturně-spektrálních korelací).

3. Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 3 Specifické výhody Ramanovy spektroskopie • Voda představuje pro Ramanovu spektroskopii ideální rozpouštědlo(na rozdíl od IČ). • Intenzívní pásy v Ramanových spektrech pocházejí od vibrací, při kterých dochází k velké změně polarizovatelnosti (např. aromatické molekuly). • Relativně snadné měření i v oblasti nízkých vlnočtů (pod 400 cm-1, daleká IČ oblast) • Selektivní rezonanční zesílení (tzv. rezonanční Ramanův jev). • Povrchem zesílený Ramanův rozptyl (SERS)

4. Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 4 Nevýhody vibrační spektroskopie • Spektrální rozlišení je sice vyšší než v elektronových spektrech, ale nižší ve srovnání s NMR. Nedostatečné rozlišení může být částečně kompenzováno chemickou (izotopická záměna) nebo biologickou (bodová mutace) modifikací. • Jsou potřeba relativně vysoké koncentrace vzorku ( 10-100 g/l) byť v malých objemech. • Jak H2O tak i D2O nejsou ideálním rozpouštědlem pro IČ spektroskopii (na rozdíl od Ramanovarozptylu). • Ramanův jev (nepružný rozptyl světla) je ze své podstaty slabý jev (ve srovnání s absorpcí nebo emisí světla). Je tedy nutná značná čistota vzorků a péče při manipulaci s nimi (velmi vadí fluorescence příměsí).

5. Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 5 Vibrační konformační markery • Pásy ve vibračním spektru představují detailní a jedinečný „otisk prstu“ dané molekuly. • Složité molekuly  vibrační módy a jim příslušející spektrální pásy nemohou být přímo přiřazeny souřadnicím výchylek atomů ani z nich jednoduše vypočítány. • vibrační spektrumnelzepoužít pro výpočet struktury. • Vibrační spektrum daného strukturního motivu nemůže sloužit jako „otisk prstu“této struktury dokud s ní není korelováno pomocínezávislé metody. • Jako základ pro stanovení takové korelace zpravidla slouží struktury určené pomocí difrakčních nebo NMR metod. • Každý pás ve spektru odpovídá vibraci specifické skupiny atomů (tzv.normální vibrační mód) s dobře definovanými geometrickými charakteristikami (délka vazby, vazebné úhly, atd.) správně přiřazený pás může sloužit jakojednoznačný indikátor (strukturní marker)tohoto strukturního rysu.

6. B-DNA A-DNA Z-DNA C2’ endo/anti C3’ endo/anti C2’ endo/anti (pyrimidiny) C3’ endo/syn (puriny) Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 6 Kanonické struktury DNA Obrázky skeletuB-DNA, A-DNA, a Z-DNA. Každé vlákno B-DNA aA-DNA obsahuje 20 nukleotidůstejné sekvence. Z-DNAje tvořena alternujícímiGC páry.

7. Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 7 Spektra kanonických struktur DNA Ramanova spektra krystalů A-, B-, a Z-DNA. Označeny jsou nukleosidové a páteřní konformační markery.

8. Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 8 Určení strukturyRNA·DNAhybridu v roztoku A·B hybrid B-form A-form A-form Ramanovaspektra • poly(rA).poly(dT), pH 7.5 v 0.1 M NaCl (A·B hybridní struktura) • poly(dA-dT).poly(dA-dT), pH 7.5 v 0.1 M NaCl (B-form) • poly(dA-dT).poly(dA-dT)vláknopři 75% relativní vlhkosti (A-form) • poly(rA).poly(dT)vláknopři 75% relativní vlhkosti (A-form)

9. Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 9 Interakce poly(rA) s poly(rU) v roztoku Soubor Ramanových spekter série vzorků poly(rA) a poly(rU) s postupně se měnícím poměrem A:U od čistého poly(rU) (červené) k čistému poly(rA) (fialové). Spektra byla normalizována a signál rozpouštědla byl odečten.

10. Interakce poly(rA) s poly(rU) Výsledky faktorové analýzy aplikované na první derivaci souboru Ramanových spekter směsi poly(rA) s poly(rU) s měnícím se poměrem A:U. faktorová dimenze = 4 Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 10

11. 11 Interakce poly(rA) s poly(rU) Byly identifikovány 4 složky: jednovláknová poly(rU), jednovláknová poly(rA), poly(rA).poly(rU) duplex a poly(rU):poly(rA)*poly(rU) triplex. Byla izolována spektra čistých komponent.

12. Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 12 Povrchem zesílený Ramanův rozptyl (SERS) Mechanismy zesílení m= a . E povrchový plasmon

13. Sanchéz-Cortés et al. Langmuir17, 1157 (2001) Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 13 Příklady SERS aktivních povrchů I zdrsněná elektroda ostrůvkovité filmy

14. Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 14 Příklady SERS aktivních povrchů II kovové koloidy (připravené chemicky nebo laserovou ablací) vlnová délka (nm) vlnová délka (nm) vlnová délka (nm)

15. Munro et al., Langmuir11, 3712 (1995) Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 15 Laserová ablace laserová ablace - příprava chemicky čistého koloidu Nd/YAG pulzní laser, 1064 nm, opakovací frekvence 10 Hz, délka pulzu 20 ns, 7 ml Ag koloidu jepřipraveno během 15 minutové ablace Procházka et al., Anal. Chem. 69, 5103 (1997)

16. Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 16 Příklady SERS aktivních povrchů III koloidní částice imobilizované na silanizovaných skleněných podložkách

17. PORPHYRIN METALATION IN Ag COLLOIDAL SYSTEMS 5,10,15,20-tetrakis(1-methyl-4-pyridyl) porphyrin (H2TMPyP)  Ag+ FREE BASE PORPHYRIN METALATED PORPHYRIN

19. Can we protect porphyrin against metalation? Yes, by appropriate molecular spacer PORPHYRIN METALATION(Undesirable or desirable effect?) Direct adsorption of free base porphyrin onto the metal surface  PORPHYRIN METALATION  • Impossible to obtain SERS spectrum of unperturbed free base porphyrin • Irreproducibility of spectral measurement   Can metalation serve to obtaininformation about Ag colloid/porphyrin system and porphyrin itself? • Detail investigation and quantitative analysis of metalation process • Determination of metalation kinetics as a probe of Ag colloid/porphyrin systems

20.  = 1 - exp (- t / ) QUANTITATIVE ANALYSIS OF METALATION PROCESS Hanzlíková et al., J. Raman Spectr.29, 575 (1998) 1. FACTOR ANALYSIS (singularvalue decomposition algorithm) 2. Construction of SERRS spectra of PURE PORPHYRIN FORMS as a linear combination of subspectra 3. Determination of METALATION KINETICS as a time-dependent fraction of pure metalated porphyrin forms in the original spectra

21. Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 21 Návrh rychlého DNA sekvenátoru na principu SERS Kneipp et al., Appl. Spectrosc.60, 322A (2007)

22. Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 22 Single molecule SERS „blinking“ Time-elapsed video image of intermittent light emission recorded from a single silver nanoparticle. The elapsed time between images is 100 ms, and the signal intensities are indicated by gray scales.

23. Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 23 Biosenzory založené na SERS ? Localized Surface Plasmon Resonance (LSPR) Surface PlasmonResonance (SPR) Surface-Enhanced Raman Scattering (SERS) lmaxof LSPR depends on the size, shape, interparticle spacing, dielectric properties of particles and local environment SERS can detect the presence of particular species and/or theirinteractions

24. Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 24 Biosenzory založené na SERS ? JACS127, 2264 (2005)

25. Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 25 Biosenzory založené na SERS ?