Molecular Genetics

1. Molecular Genetics

2. Molecular Genetics 1. Replication and Recombination 2. Transcription and Regulation 3. Translation and Regulation 4. Gene mutation and Repair 5. Developmental Genetics 6. Gene cloning

3. Central Dogma of Molecular Biology

4. Central Dogma of Molecular Biology การถ่าย หรือ การไหลของข้อมูลพันธุกรรม (Transfer of Genetic Information) จาก Nucleic acid (DNA) ไปยัง Nucleic acid (RNA) และ จาก Nucleic acid (RNA) ไปยัง Protein (product of gene) โดย 3 fundamental processes ของ 1. Replication 2. Transcription 3. Translation

5. The Flow of Genetic Information

6. Central Dogma of Molecular Genetics(1st version)

7. Replication

9. DNA Replication • การสังเคราะห์ DNA (DNA synthesis) • Synthesis ให้ daughter duplex DNA โดย DNA molecules จะเหมือน parental duplex DNA ทุกประการ

10. Replication theory 3 possible models 1. Semiconservative replication : กึ่งอนุรักษ์ 2. Conservative replication : อนุรักษ์ 3. Dispersive replication : อนุรักษ์และกระจาย

11. Mechanism of DNA Replication DNA replication 2 processes ใน เวลาเดียวกัน 1. Semi conservative replication 2. Discontinuous replication

12. 1. Semiconservative replication • DNA replicateโดยใช้ 2 สายเดิมเป็น สายแม่แบบ (Template) • DNA polymerase enzyme ใส่ nucleotides ที่เป็นcomplementary เข้าไปจับคู่กับ nucleotides บนสายแม่แบบ ได้สายลูก 2 สาย • DNA ลูกจึงเป็นสายผสมระหว่างสายแม่แบบกับสายผลิตใหม่

13. Semiconservative replication DNA 2 สายลูก เป็น สายคู่ (duplex) ซึ่ง ในแต่ละ daughter duplex มี DNA สายใหม่ 1 สาย (แดง) และ DNA สายเก่า 1 สาย (ดำ)

14. การพิสูจน์ Semireplication Meselson-Stalh experiment

15. 2. Discontinuous replication • Replication ให้ได้ 2 DNA duplex • โดย สายหนึ่ง replicate ได้ สายยาวอย่าง ต่อเนื่อง และ • อีกสายหนึ่ง replicate เป็นช่วงสั้นๆ แล้วจึงถูกต่อเป็นสายต่อเนื่องภายหลัง

16. Discontinuous replication แม่แบบ Template 2 สาย ให้ replication ต่างกัน 1) Template ให้ เกิด Continuous replication เรียกว่า Leading strand ซึ่งคือสาย 3’ --> 5’ 2) Template ให้ เกิด Discontinuous replication เรียกว่า Lagging strand ซึ่งคือสาย 5’-->3’

17. Direction of replication 1. การยาวของสาย DNA ทิศทางจาก 5’ --> 3’ เสมอ • เพราะ DNA polymerase enzyme จะนำ nucleotides ต่อเข้าที่ 3’ end ของ สายที่มีอยู่แล้ว (existing chain หรือ primer) • ทำให้ สาย DNA สายใหม่ ยาว จาก 5’ -> 3’ เสมอ • บริเวณที่ DNA แม่แบบ 2 สายแยกออกจากกันจะเป็นรูปส้อม หรือ ง่าม เรียกว่า Replication folk

18. 2. การเจริญของสายลูก ได้ 2 ทาง • โดยดูจาก Replication ที่ออกจาก origin site (ori) 21. Unidirectional replication เจริญออกปลายเดียว ปลายหนึ่งอยู่กับที่ เป็น stationary fork และ อีกปลายหนึ่งเจริญเคลื่อนที่ เป็น moving fork 2.2 Bidirectional replication เจริญออกสองปลายทั้ง 2 ปลาย เป็น moving forks

19. Unidirectional replication (b)Bidirectional replication (c)

20. Replication ไม่เริ่มที่ปลายสาย DNA แต่เริ่มที่ ตำแหน่งเริ่ม ต้นที่เรียกว่า Origin of replication หรือ ori site circular DNA มี ori site เดียว linear DNA มีได้หลาย ori sites และ แต่ละช่วงของ replication (สังเคราะห์ 1 ช่วง จาก 1 origin คือ 1 หน่วย replication เรียกว่า Replicon

21. Machinery ใน Replication 1. DNA polymerase 2. Helicase 3. Topoisomerase / DNA gyrase 4. Single - Strand - Binding (SSB) protein 5. DNA Primase 6. DNA Ligase

22. Mechanism ของ replication • Replication บน Leading template strand (3’ --> 5’)เป็น Continuous replication • Replication บน Lagging template strand (5’ --> 3’)เป็นแบบ Discontinuous replication

23. Diagram สรุป Mechanism ของ DNA replication

24. Mechanism ของ Replication บน Leading Template Strand (3’ --> 5’) 1. Helicase • ทำหน้าที่ แยก 2 parental DNA strands ณ replication fork • การทำงาน ของ helicase ใช้พลังงาน ATP ในเซลล์จำนวนมาก • การแยก 1 base pair ต้องใช้ 2 ATP

25. 2. Topoisomerase / DNA gyrase คลายเกลียว DNA duplex ที่มากเกินไปจนเป็น Supercoil จากการคลายเกลียวโดย Helicase • Topoisomerase ทำให้ลดแรง ตึง (strain) ให้เป็น อย่างใดอย่างหนึ่ง • reduced DNA coiling หรือ relaxed หรือ • negatively supercoiled (under เกลียวน้อยลง) หรือ • positively supercoiled (over เกลียวมากขึ้น)

26. 3. ป้องกันไม่ DNA สายเดียวทำเกลียว Duplex กลับคืนด้วย Single - Strand - Binding (SSB) protein SSB ทำหน้าที่จับ และเคลือบ single - stranded DNA บริเวณ replication fork ทันทีที่ถูก Helicase แยกออก และป้องกันไม่ให้ DNA ถูกย่อย

27. Topoisomerase ทำให้ Relaxed DNA (รูปกลาง) หมุนขวามากเกินไป (รูปซ้าย) หรือ หมุนซ้ายเกินไป (รูปขวา) Topoisomerase ตัด DNA 1 สาย และ สายนี้คลายเกียวออก ทำให้ release stress บนสาย DNA

28. 3’ 5’ การทำงานของ Helicase และ DNA polymerase 5’

29. 4. การเตรียม Primerสำหรับเริ่มต้น - Priming of DNA ณ จุด ori site มี nucleotides จำนวนหนึ่ง เรียกว่า Primer ซึ่งเป็น RNA สร้างขึ้น ที่ปลาย 3’ ของสายแม่แบบก่อน โดย enzyme Primase

30. 5. การต่อเติม nucleotide โดย DNA Polymerase ซึ่งทำหน้าที่ 1) ใส่ nucleotides เข้าที่ 3’ ของ primer หรือ existing chain 2) check complementary bases: เป็น Exonuclease ตัด base ที่ผิด ออก และ ไส่ nucleotides ที่ถูก ต้อง เรียกว่า Proofreading 3) repair DNA เมื่อมี damage

31. Three activities of DNA Polymerase a. Polymerase b. Endonuclease c. Exonuclease

32. Mechanism ของ Replication บน Lagging Template Strand 6. การสร้าง Okazaki fragment บนสาย Lagging template • สร้าง DNA จาก 5’ --> 3’ ปกติ แต่ได้เป็นท่อนสั้นๆ โดยสร้าง Primer ก่อน แล้วสร้างท่อน DNA ซึ่ง เรียกว่า Okazaki fragment • แล้ว Okazaki fragment จะถูกเชื่อมกันโดย enzyme DNA Ligase • เมื่อ primer สลายไป DNA polymerase I จะนำ nucleotides เติมช่องว่างให้เต็ม และ • Ligase ต่อ bond สุดท้ายระหว่าง 2 nucleotides ได้สาย DNA ที่ต่อเนื่องเป็นปกติ

33. Priming ก่อนสร้าง และGap filling หลัง สร้าง Okazaki fragment

34. Diagram สรุป Mechanism ของ DNA replication

35. 7. การเติม nucleotides ที่ ปลาย 5’ ให้สมบูรณ์ เกิดกับ DNA ชนิดเส้นตรง (linear DNA) บนแม่แบบ leading และ lagging strand เริ่ม replication ด้วย การสร้าง RNA primer ขึ้นที่ปลาย 5’ เป็นที่ตั้งต้นให้ DNA polymerase สร้างสายลูก RNA primer ถูกสลายออก ทำให้ ที่ปลาย 5’ ของ DNA สายลูก สั้นกว่าสายแม่

36. จึงต้องเติม nucleotide คู่สมใส่ให้ได้สายลูกที่สมบูรณ์โดย Telomerase enzyme ที่ 3’ end ของ DNA สายแม่แบบ • Telomerase ทำหน้าที่ใส่ GC -rich sequence สั้น ๆ ให้เป็นเสมือน เป็นส่วนต่อของสายแม่แบบ • ใน Telomersae มี RNA เป็น primer ให้ DNA polymerase ต่อ nucleotides ที่สายลูก • ในสิ่งมีชีวิตพวก eukaryote ถ้าปลาย Telomere ของ chromosome ขาดหายไป หรือ สั้นกว่าปกติ ทำให้เป็นโรคทางพันธุกรรม คือ โรคแก่ตั้งแต่วัยเด็ก นั่นคือ Telomerase มี gene (s) เกี่ยวกับการแก่ (Aging)

37. การต่อ Telomere โดย Telomerase

38. ความซื่อตรงของการสังเคราะห์ DNA Fidelity of replication 1. Complex mechanism มี DNA polymerase ทำหน้าที่เป็น 3’ ---> 5’ Exonuclease ทำการ proofreading โดย ดัตเอา mismatched nucleotides ออก แล้วนำ nucleotides ที่ถูกต้องใส่เข้าไปแทนที่ 2. Primer เป็น RNA ซึ่งเป็นการ guarantee ว่าการเริ่มต้น DNA replication ไม่มีความผิดพลาด

39. Modes of Replication of Circular DNA ใน Prokaryotes :bacteria, mitochondria และ chloroplast 1. Theta model 2. D-loop form ใน bacteriophage 3. Rolling circle model หรือ Sigma mode

40. Rolling circle Modes of replication of circular DNA D form Theta form

41. Recombination

42. Recombination เป็นหลักการของ 1. Crossing over 2. Independent assortment

43. Recombination การตัดและเชื่อมต่อชิ้นส่วนของ genes, ชุดของ genes, หรือส่วนของ genes ให้เป็น combinations ใหม่ Recombination เกิดโดย ธรรมชาติ หรือ โดยการทดลอง ทำให้ chromosome ของ ลูกมี genes ผสมที่แตกต่างกัน มากกว่าที่พบใน Parents หรือได้ Non-parental chromosomes ทำให้สิ่งมีชีวิตปรับตัวรอดในธรรมชาติ ได้ดีกว่า

44. Types ของ Crossing overa. Double crossoverb. Triple crossoverc. Quadruple crossover

45. Types of Recombination 1. Bimolecular recombination 2. Intramolecular recombination 3. Site-specific recombination 4. Illegitimate recombination 5. Homologous recombination หรือ Generalized recombination

46. 1. Bimolecular recombination การแลกชิ้นส่วนระหว่างต่าง DNA 2 โมเลกุล • 1.1 Reciprocal recombination : แลกสลับกันทั้งสอง 2 โมเลกุล • 1.2 Nonreciprocal recombination : ไม่แลกสลับกัน • 1.3 Double crossover :recombination 2 ตำแหน่ง

47. 2. Intramolecular recombinationการแลกชิ้นส่วนของ DNA โมเลกุลเดียวกัน • 2.1 Directional repeat recombination • 2.2 Inverted repeat recombination

48. 3. Site-specific recombinationระหว่าง DNA sequence ที่เหมือนกัน หรือ DNA regions เดียวกันของแต่ละ Strand เช่น insertion ของ l phage DNA เข้า host DNA ซึ่งเป็น E. coli

49. 4. Illegitimate recombinationการแลกชิ้นส่วนระหว่าง DNA sequences ต่างกัน หรือ เหมือนกันเล็กน้อยแต่ไม่มี site - specific เช่น Transposable elements หรือ Transposon ซึ่งคือ genes ที่สามารถเคลื่อนย้ายที่จาก chromosome หนึ่งไปยังอีก chromosome หนึ่งได้ โดยไม่ต้องมีตำแหน่งตัดเชื่อมที่แน่นอน เช่น สีของเมล็ดข้าวโพดอินเดียน

50. 5. Homologous recombination หรือ generalized recombination ระหว่าง homologous pieces ของ DNA เป็น common form ของ recombination ที่เกิดขึ้นใน meiosis Mechanism เสนอโดย Robin Holiday, 1964 เรียกว่า Holiday Model