صدق الله العظيم

2. وننزل من القرآن ما هو شفاء ورحمة للمؤمنين ولا يزيد الظالمين إلا خسارا صدق الله العظيم

3. عمل الطالبتان لينا العنزي 2870441 أماني المطيري 2870167 المملكة العربية السعودية وزارة التعليم العالي جامعة طيبة مقدم للدكتورة : سحر

4. Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) تفاعل سلسلة البوليميراز بالزمن الحقيقيّ التالي السابق

5. تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي rtPCR • تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي اللحظي (بالإنجليزية: real-time polymerase chain reaction) ويسمى أيضا تفاعل البوليميراز المتسلسل ألكمي اللحظي (بالإنجليزية: quantitative real time polymerase chain reaction) (بسبب قياسه كمية الحمض النووي أيضا) أو أيضا تفاعل البوليمراز المتسلسل الحركي وهو أداة مهمة في علم ألأحياء الجزيئي. تعتمد هذه التقنية المخبرية على نفس مبدأتفاعل البوليميراز المتسلسل

6. تفاعل سلسلة البوليميراز بالزمن الحقيقيّ Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) هو طريقة كميةٌ جزيئية تعمل على تحويل الحمض الريبي النووي المِرْسال mRNA أو الـ RNA غير المُرَمِّزْ Non-coding إلى دنا متمم cDNA، وذلك باستخدام إنزيم الناسِخَةِ العَكْسِيَّةِ Reverse Transpcriptase. ثم يجري تضخيم موقعٍ محددٍ أو أكثر من الدنا وذلك باستخدام إنزيم بوليميراز Taq-DNA Polymerase.

7. ويظهر القياس الكميّ للدنا المُضَخَّمِ مباشرةً مع نهاية كلِّ دورة من التفاعل، وذلك بدون الحاجة للانتظار حتى نهاية التفاعل، ومن هنا جاء اسم الطريقة.  تُنظِّمُ الخلايا كلاًّ من التعبير الجيني Gene Expression والمنتج البروتينيّ الناجم عن هذا التعبير. ولذلك تعد تقانةالـRT-PCR وسيلةً عمليةً للتحري الكميِّ، وذلك عبر قياس الكميات الضئيلة جداً من الـmRNA. كما يمكن استخدام الطريقة في كشف وتقدير وجود تتالي معين من الدناDNA في عينات اختبارية.تقوم الطريقة على استخدام أصبغة متفلورة، حيث يرتبط الصباغ المتفلور بشكلٍ نوعيٍّ مع كامل الدنا مضاعف السلسلة dsDNAمعطياً فلورة بنسبةٍ محددة.

8. تفاعل البوليميراز المتسلسل اللحظي الكمي يستخدم جزيئات الفلوروفور (مولدة للضوء أو حاملةفلورية) للكشف عن مستوى التعبير الجيني

9. تابع وفي تفاعل الـRT-PCR، فإنَّ تضخيم منطقةٍ محددةٍ من عينة الدنا سوف يزيد من شدة الفلورة، وذلك بسبب ازدياد ارتباط الأصبغةالمتفلورة، وتُقاس الفلورة مع نهاية كلِّ دورة تفاعلية، مما يسمح بالقياس الكميّ للدنا المُضَخَّمْ في منطقة ذات تتالي معين من النوكليوتيدات.

10. خطوات عمل طريقة الـRT-PCR: يُسْتَعْمَلُ مشرعان Primers يحددان ويحصران منطقةً من الـدنا يُرادُ تضخيمها، ومسباران، الأول مسبارٌمتفلورٌ مُخبِر Fluorescent Reporter والثاني مسبارمُخَمِّدٌFluorescent Quencher، ويكونان عادةً قريبين جداً من بعضهما. تؤدي الزيادة في تضخيم الدناDNA مع كل دورةٍ لمنطقة المسبار المخبر إلى زيادة نسبيةٍ في الفلورة، ويعود ذلك إلى تحرر المسبار المخبر عن المسبارالمخمد. ويجري ذلك تبعاً للخطوات التالية:

11. تابع للخطوات 1. تُحضَّرُ العينة التفاعلية للـ RT-PCR ويُضاف المسباران المتفلوران.2. يبدأ تفاعل الـ RT-PCR عبر ارتباط المشرعين والمسبارين على الموقع الهدف المراد تضخيمه في عينة الدنا DNA أو RNA.3. يبدأ إنزيم بوليميراز الدنا Taq-Polymerase بالعمل وتضخيم المنطقة بين المشرعين، وحالما يصل الإنزيم إلى منطقة المسبارين، فإنَّ إنزيم البوليميراز له قدرة نزع المسبارين (Exonuclease activity) بالاتجاه 5' إلى 3'، مما يؤدي إلى فصل المسبارين عن بعضهما، ويزيد من الفلورة التي يجري قياسها ليزرياً.

12. 4. يقيس جهاز الـ RT-PCR الفلورة وازدياد شدتها مع كل دورة تضخيمية بحسب العلاقة الأسية لتضخيم الدنا، وذلك أثناء الطور الأسيّ للتضخيم Exponential phase. ثم يجري تعيين التركيز النسبيّ للدنا عبر إسقاط قيم الفلورة على عدد دورات التضخيم بحسب المقياس اللوغاريتمي.5. يقيس جهاز الـ RT-PCR كمية الـ RNA أو الـ DNA عبر مقارنة النتائج مع خطٍ معياريٍّ ينفذه الجهاز عبر استخدام سلسلةٍ ممددةٍ معيارية معروفة التركيز من الـ RNA أو الـ DNA.

13. التطبيقات السريرية لتفاعل الـRT- PCR: • يعد كشف الحمات الرنوية بواسطة هذا الاختبار أكثر التطبيقات السريرية أهمية إلى يومنا هذا. • هذا وقد أصبحت المقايسات الكمية لـ RT- PCR شيئ مألوف بالنسبة لكشف الـ HIV والـ HCV . • فعندما تستخدم الطبيعة الكمية لتضخيم الحمض النووي بالاقتران مع عياريات Standards كمية خارجية (عادة ما تستخدم لقياس كمية هذه الحمات الموجودة في دم المريض ) والتي تعرف عادة بالحمل الحموي Viral load.

14. فائدةRT- PCR  بالنسبة لمرضى التهاب السحايا الحموي: أيضاً استخدمت هذه التقنية بشكل واسع لكشف الأسباب الحموية لالتهاب السحايا والتهاب السحايا والدماغ مثل الحمات المعوية enterovirusesوحمة غرب النيلNile West virus. وجميع الحمات التالية: حماتالضنك dengue حمةHanta الحمة نظيرة الرئوية البشرية human metapneumovirusوالحمة التاجية coronavirusالمسببة للمتلازمة الرئوية الحادة الصاعقة ( SARS) قد اكتشفت جميعها بهذه التقنية .

15. الطرائق الشائعة لتفاعل الـReal – Time PCR: 1-استخدام الأصبغة المتفلورة التي تتداخل مع الدنا ثنائي الطاق. ازدياد تركيز الدنا مضاعف الطاق في تفاعل الـ PCR سيؤدي إلى ازدياد شدة الفلورة أو التألق التي تقاس في كل دورة PCR (في نهاية مرحلة الإطالة لأن كافة جزيئات الدنا تكون في هذه المرحلة ثنائية الطاق) • 2- مسابير من الدنا معدلة مؤلفة من عدة نكليوتيدات والتي تتألق عندما تتهجن مع طاق الدنا المكمل الموافق لها. • هي الطريقة الأكثر دقة ومعولية ولكنها أكثر تكلفة. • إنها تستخدم مسابير مصنوعة من الدنا أو الرنا نوعية بالناتج المراد كشفه، لذلك فإن هذه الطريقة نوعية حيث بالإمكان قياس تركيز الدنا المستهدف حتى في حال وجود نواتج غير نوعية.

16. تطبيقاتReal – Time PCR • يمكن استخدام هذه التقنية في التطبيقات الروتينية لتفاعل الـ PCR التقليدي. وكذلك للتطبيقات التي لا يتناسب معها الـ PCR التقليدي: • 1- المعايرات الكمية للحمات. • 2- القياس الكمي للتعبير الجيني. • 3- فعالية المعالجة الدوائية. • 4- قياس الأذى للدنا. • 5- في اكتشاف العوامل الممرضة الخمجية. • 6- التنميط الوراثي.

17. المصادر 1- د.علي ابراهيمhttp://dc399.4shared.com/doc/QBpQ80af/preview.html 4- ويكيبيديا الموسوعة الحرة http://ar.wikipedia.org/wiki/%D8%AA%D9%81%D8%A7%D8%B9%D9%84_%D8%A7%D9%84