Année Universitaire 2010-2011 UE5 Cours du Dr R. GARNOTEL

1. Année Universitaire 2010-2011 UE5 Cours du Dr R. GARNOTEL Les lignées cellulaires : culture de cellules hématopoïétiques

2. 1 – INTRODUCTION 2 – HEMATOPOIESE 2.1. Les cellules hématopoïétiques 2.2. Régulation de l’hématopoïèse 3 – CULTURES DE CELLULES HEMATOPOIETIQUES 3.1. Culture à partir de cellules souches issues de la moelle osseuse 3.2. Culture de cellules dérivées de lignées leucémiques 3.3. Différenciation des monocytes ex vivo

3. 4 – APPLICATIONS 4.1. Cytométrie en flux 4.2. Etudes biochimiques 4.3. Implications fonctionnelles CONCLUSION

4. 1 – INTRODUCTION Hématopoïèse : ensemble des mécanismes assurant le remplacement continu et régulé des différentes cellules sanguines Les cellules sanguines comportent 8 lignées différentes : - hématies - polynucléaires neutrophiles - polynucléaires éosinophiles - polynucléaires basophiles - monocytes - lymphocytes B - lymphocytes T - plaquettes

6. Certaines cellules dans le sang sont en transit de la moelle vers les tissus : - polynucléaires y sont détruits - monocytes  macrophages - éosinophiles  mastocytes Malgré des capacités de prolifération nulles ou très faibles, et une durée de vie limitée (hématies : 120 jours, plaquettes : 7 jours, polynucléaires neutrophiles : 24 heures), leur nombre reste constant, nécessitant leur remplacement perpétuel Chaque heure sont ainsi produits 1 X 1010 hématies et 4 X 108 leucocytes  Prolifération rapide à partir de cellules souches

8. Il y a 3 grands types de culture à partir de cellules sanguines : • culture à partir de cellules souches issues de la moelle • osseuse  obtention de différentes lignées • culture de cellules dérivées de lignées leucémiques : • * cellules K562 • * cellules THP-1 • cas particulier : différenciation de monocytes en cellules • dendritiques

9. 2 – HEMATOPOIESE • 2.1. Les cellules hématopoïétiques • Les cellules souches hématopoïétiques capables de se • différencier et de s’auto-renouveller, sont présentesdans • la moelle • Schématiquement, on peut définir 3 compartiments cellulaires : • les cellules souches pluripotentes : cellules très primitives • ayant un haut pouvoir de prolifération, capables d’auto- • renouvellement et de différenciation vers toutes les lignées • hématopoïétiques

10. les progéniteurs, capables de proliférer, sans s’auto- • renouveller et de se différencier • Les cellules sont déjà engagées vers une lignée cellulaire • * CFU-E (Colony Forming Unit)  hématies • * CFU-Meg  plaquettes • * CFU-GM  polynucléaires, monocytes, lymphocytes • les précurseurs, cellules déjà reconnaissables morphologi- • quement, correspondant à des cellules en cours de • maturation avant leur passage dans la circulation sanguine

12. 2.2. Régulation de l’hématopoïèse Elle doit être parfaitement contrôlée afin que chaque élément figuré du sang soit produit en quantité et en temps voulus Schématiquement, on peut diviser les éléments régulateurs de L’hématopoïèse en 2 grandes catégories : - les facteurs de croissance - le microenvironnement Les facteurs de croissance Facteurs nécessaires au développement de cellules hématopoïétiques Ce sont des glycoprotéines à des concentrations très faibles, de l’ordre de la nanomole ou de la picomole Ils peuvent être divisés en 2 grands groupes principaux : * les facteurs de régulation positive * les facteurs de régulation négative

13. Les facteurs de régulation positive : • CSF ‘Colony Stimulating Factor) capables de donner des • colonies de cellules hématopoïétiques • Certaines de ces molécules agissent sur des progéniteurs • précoces et ne sont pas spécifiques d’une lignée donnée • (GM-CSF, IL-3) • D’autres ont une action restreinte à une lignée et sont • nécessaires à l’acquisition des caractères de différenciation • spécifique des cellules matures (érythropoïétine, IL-5) • * IL-3 : toutes lignées • * GM-CSF, M-CSF : leucocytes • * érythropoïétine (EPO) : hématies • * thrombopoïétine : plaquettes • * IL-5 : polynucléaires éosinophiles • * SCF (Stem Cell Factor) : action synergique avec tous • les autres facteurs de croissance hématopoïétiques

14. Les facteurs de régulation négative (utilisation in vitro) • * TGF-b • * TNF-a • Rôle possible dans l’inhibition de la croissance des cellules • leucémiques

15. Le microenvironnement • Il constitue le cadre dans lequel se développent les cellules • hématopoïétiques • Il est formé : • de cellules : fibroblastes, cellules endothéliales, • macrophages, adipocytes • Toutes ces cellules sont capables de sécréter tous les • facteurs de croissance, mais aussi les inhibiteurs de l’ • hématopoïèse • d’une matrice extra-cellulaire : réseau de fibres complexe • auquel viennent adhérer les cellules hématopoïétiques • Cette adhérence est capitale, dans la mesure où la matrice • extra-cellulaire constitue un réservoir considérable en • facteurs de croissance

16. 3 – CULTURES DE CELLULES HEMATOPOIETIQUES 3.1. Culture à partir de cellules souches issues de la moelle osseuse But Etude des progéniteurs lors de circonstances pathologiques telles que : * aplasie * dysmyelopoïèse * leucémies Prélèvement Prélèvement de moelle osseuse

18. Principe de la technique • Les cellules hématopoïétiques peuvent survivre, proliférer et • se différencier en culture si, et seulement si, on leur fournit • des facteurs de croissance spécifiques ou si on les cultive en • présence de cellules qui produisent ces facteurs • Si elles sont privées de ces facteurs, les cellules meurent • La prolifération à long terme de cellules souches multi- • potentes peut être obtenue en cultivant des cellules • hématopoïétiques de la moelle osseuse sur une couche de • cellules stromales médullaires, reconstituant l’environnement • de la moelle osseuse •  Tous les types de cellules myéloïdes

19. Les cellules hématopoïétiques dispersées de la moelle • osseuse peuvent être cultivées sur une matrice semi-solide • d’agar ou de méthyl-cellulose, et des facteurs dérivés d’autres • cellules peuvent être artificiellement ajoutés au milieu • Parce que les cellules ne peuvent pas migrer dans cette matrice • semi-solide, la descendance de chaque cellule précurseur • isolée reste groupée pour former une colonie aisément • repérable • Par exemple, une cellule précurseur déterminée pour • engendrer des neutrophiles donnera lieu à un clone contenant • des milliers de neutrophiles

21. 3.2. Culture de cellules dérivées de lignées leucémiques But Etudes in vitro Principe de la technique C’est une culturecellulaire en suspension Les cellules (lignées) sont mises en suspension dans du milieu de culture classique (DMEM, RPMI) en présence de 10% de SVF (sérum de veau fœtal) Les cellules se multiplient rapidement (temps de doublement moyen est de quelques heures) Le milieu contenant les cellules est centrifugé et le culot cellulaire remis en suspension soit pour prolonger la multiplication soit à fin d’études La différenciation est possible vers différentes lignées en fonction de l’agent stimulant

22. 3.3. Différenciation des monocytes ex vivo But Approche thérapeutique de l’utilisation des cellules dendritiques dans le traitement du cancer Principe de la technique La différenciation des monocytes ex vivo est effectuée par culture d’une semaine environ en milieu défini, en présence de cytokines et de facteurs de croissance spécifiques Les monocytes sont différenciés en cellules dendritiques en présence d’IL-3 et de GM-CSF

23. Les cellules mononuclées du sang périphérique sont collectés par aphérèse permettant de recueillir 10 milliards de cellules contenant 10 à 20% de monocytes Les monocytes sont séparés par élutriation avec une viabilité et une pureté de l’ordre de 95% Le différenciation en cellules dendritiques pendant 7 jours en présence d’IL-13 et de GN-CSF est suivie d’une activation La maturation des cellules dendritiques stimulant des lymphocytes T et secrétant de l’IL-12 est induite de manière irréversible après 6 heures de culture en présence d’IFN-g et de liposaccharide de synthèse Durant cette période de maturation, les cellules dendritiques sont chargées par des antigènes spécifiques des tumeurs L’ensemble du processus, depuis l’aphérèse jusqu’à l’injection au patient, se fait stérilement en circuit fermé

24. 4 – APPLICATIONS 4.1. Cytométrie en flux Vérifier la différenciation cellulaire 4.2. Etudes biochimiques - Adhésion sur la matrice extra-cellulaire - Activation cellulaire - Transduction du signal 4.3. Implications fonctionnelles - Inflammation - Infection - Athérosclérose

25. CONCLUSION Trois types de cultures avec trois buts différents : - diagnostic - études cellulaires - thérapeutique