Albert Font Inglès

1. Glycosylation engineering in yeastHumanització del llevat per producció de proteïnes terapèutiques Albert Font Inglès

2. Mercat de les proteïnes terapèutiques • És un mercat que ha crescut ràpidament des de que va néixer fa uns 30 anys. • Actualment estan aprovades 140 proteïnes d’ús farmacèutic als mercats dels EUA i Europa, i n’hi han 500 més en proves. • En el 2003 el mercat de les proteïnes recombinants terapèutiques estava valorat en 30 bilions de $. • Avui en dia una quarta part dels nous fàrmacs que s’aproven per l’ús terapèutic estan basats en proteïnes, i la majoria d’elles són glicoproteïnes (bàsicament anticossos monoclonals) Sources : BiotechGuide 2007

3. Importància de la glicosilació La N-glicosilació afecta; • La vida mitja en plasma - Degut al PM i a la càrrega neta - Activació de sistemes de clearance lectin-mediated receptor (asialoglicoproteins o proteïnes amb manoses terminals) - L’Eritropoietina (EPO) necessita de l’àcid siàlic per mantenir-se estable en plasma • L’Especificitat de teixit • L’Activitat biològica - Tenen efecte en l’eficàcia de la interacció amb els receptors - Les immunoglobulines necessiten de N-glicosilacions per la interacció amb el receptor

4. Fonts de les glicoproteïnes • Tradicionalment s’han derivat de fonts humanes o animals (human serum albumin, insulin…) Problema: Contaminació viral i purificació • Sistemes recombinants clàssics - Cèl·lules de mamífer - Bactèria - Llevat - Cèl·lules d’insecte - Altres… Claus avaluadores d’un hoste d’expressió: • Cost de fabricació i purificació • Habilitat per controlar el producte final (incloses modificacions post-traduccionals) • El temps de desenvolupament del gen a la proteïna purificada • Royalties

5. Sistemes recombinants • Mammalian Cell cultures CHO cells (Chinese Hamster Ovary ) Avantatges • Gran Know-how i un procés fàcilment escalable • Capacitat inherent de glicosilar com els mamífers Desavantatges • Costos molt elevats de producció • Facilitat d’expansió de virus, prions … • Les seves glicoproteïnes mostren un elevat grau d’heterogeneïtat en la glicosilació, resultant en molta varietat del producte de lot a lot. • Insect Cell lines • S’han utilitzat per l’expressió de varies glicoproteïnes • No fan N-glicosilacions de tipus complexa • Alguns residus de paucimannose, mannose etc … fan baixar la vida mitja • Algunes línies cel·lulars afegeixen α-1,3-fucose glicans, altament immunogèniques

6. Sistemes recombinants • Plantes Transgèniques • Bàsicament tenen el problema de la falta de galactosa i àcid siàlic, i la presència d’alguns sucres immunogènics com xilosa o α-1,3-fucosa. • Animals Transgènics • S’han expressat diferents glicoproteïnes (inclosos anticossos monoclonals) • Les N-glicosilacions tenen moltes manoses i amb baix contingut d’àcid siàlic (comparat amb humans) • Llevat (S. cerevisiae, P. pastoris …) • Sistema robust i en el qual es disposen d’innumerable eines genètiques • Escalable fins a 100 m3 • Fan N-glycosilació, però afegint moltes manoses (Hypermannosylation)

7. Comparativa entre les rutes de glicosilació humana i de llevat

8. Humanització del llevatPrimeres temptatives • Així doncs, humanitzar la maquinària de glicosilació de Pichia Pastoris requerirà; • Knockout de diferents gens implicats en les vies endògenes del llevat (manosiltransferases) • Recreació de la seqüència natural de glicosilació en humans (manosidases, glicosiltransferases…)

9. Humanització del llevat • L’Any 2000 Tillman Gerngross es proposa; • Desenvolupar mètodes per localitzar en orgànuls específics enzims d’altres especies relacionats en la glicosilació • Desenvolupar mètodes per veure si aquests enzims són actius en la seva nova localització • Desenvolupar tècniques fiables d’screening per identificar les soques que hagin adquirit la habilitat • En aquest article desenvolupen dues eines bàsiques per sobrepassar els reptes anteriors; • Una llibreria genètica, generant centenars de constructes de fusió • Screening d’alt rendiment, permetent analitzar un gran nombre de soques en paral·lel • Les llibreries consistien en arrays de diferents proteïnes de fusió, on cadascuna estava formada per un pèptid senyal de localització i un domini catalític

10. Humanització del llevat • Knockout del gen och1 (α-1,6-manosiltransferasa) • És l’enzim encarregat d’iniciar la hipermanosilació. • La proteïna K3 secretada com a reporter protein. • Expressió del constructe de fusió α-1,2-manosidasa (MNS I) en una soca Δ och1 • Obtenció d’un N-glicà amb pes consistent amb Man5GlcNAc2 • El clon que millor rendiment donava era aquell amb el domini catalític de C. elegans fusionada amb MNS1 de S. cerevisiae • Expressió del constructe d’expressió GnTI en una soca Δ och1 amb activitat α-1,2-manosidasa • La fusió de GnTI humana permetia el pas de Man5GlcNAc2 a GlcNAcMan5GlcNAc2 • En aquesta reacció es requereix de UDP-GlcNAc com a substrat en el golgi, i per assegurar nivells suficients es va clonar un transportador de UDP-GlcNAc de Kluyveromyces lactis

11. Humanització del llevatPresentació • En aquest treball es presenta una alternativa a l’ús de la manosidasa II, interferint en l’assemblatge de l’oligosacàrid en el pas d’unió al grup dolichol • ALG3 és l’enzim encarregat d’addicionar la sisena manosa al precursor durant l’assemblatge de l’oligosacàrid al RE. • La deleció de alg3 en P. pastoris juntament amb l’expressió localitzada de α-1,2 manosidasa hauria de generar Man3GlcNAc2, un intermediari sintètic ideal per construir una ruta de glicosilació artificial. Schachter and co-workers ja varen demostrar que aquesta forma serveix com a substrat per la GnTI.

12. Humanització del llevatProcediment I • Knockout del gen alg3 en una soca Δ och1 amb activitat α-1,2-manosidasa (MNS I) i N-acetilglucosaminotransferasa (GnTI) • En mamífers el pas de GlcNAcMan5 a GlcNAcMan3 es fa mitjançant la manosidasa II • En aquest cas al tenir un KO sobre alg3 els oligosacàrids del RE tan sols contindrien 5 manoses, que amb l’acció de α-1,2-manosidasa en el golgi es quedaria amb 3 manoses

13. P. pastoris Humans Humanització del llevatProcediment II • Producció de glicans complexes: Expressió funcional de GnTII • En mamífers l’estructura generada per la MnsII serveix com a substrat per la GnTII • Expressant el domini catalític de GnTII en els primers passos del Golgi s’aconsegueix eliminar l’addició d’α-1,2-manoses, permetent assolir GlcNAc2Man3GlcNAc2

14. Humanització del llevatProcediment III • Transferència in vivo de Galactosa • En estudis previs es demostra que P. pastoris és incapaç no tan sols de transferir galactosa, sinó de generar UDP-galactosa com a substrat • Dissenyen una proteïna de fusió de 3 subunitats diferents sota control del promotor GAP; • 36 aa de ScMnn2 com a pèptid senyal • La UDP-galactosa 4-epimerasa sencera (S. pombe) • GalT I humana sense els primers 43 aa Per tant, sembla que l’eliminació del gen alg3, en combinació amb l’adequada localització de MNS I, GnTI, GnTII i la triple proteïna de fusió per l’addició de galactosa ens dóna uns sucres de tipus complex que en molts casos són iguals que els d’humans excepte per aquelles glicoproteïnes que requereixen d’àcid siàlic.

15. Humanització del llevatPas final: Sialització • La sialització final de la glicosilació representava el repte més important; • P. pastoris és incapaç de produir cytidine monophosphate (CMP)-sialic acid • P. pastoris no té el transportador perquè CMP-sialic entri al Golgi • P. pastoris li manca la sialyl-transferasa per transferir el siàlic al residu de galactosa • Per assolir la sialització es va partir de les soques capaces d’incorporar galactosa als residus i s’hi van clonar 5 enzims amb l’ús de codó optimitzat en un sol vector; • UDP-N-acetylglucosamine-2-epimerase/N-acetylmannosamine kinase (GNE) H. sapiens • N-acetylneuraminate-9-phosphate synthase (SPS) H. sapiens • CMP-sialic acid synthase (CSS) H. sapiens • CMP-sialic acid transporter (CST) M. musculus • Llibreria de sialiltransferases quimèriques unides a un domini transmembrana de llevat (ST) • Amb aquesta estratègia aconseguien que el 90,5% de la EPO recombinant portes a estructures de glicosilació amb àcid siàlic.

16. Bibliografia • Challenges in therapauric glycoprotein productionNatarajan Sethuraman Current Opinion in Biotechnology 2006 • Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi Tillman U Gerngross Nature Biotechnology • Engineering of an artificial glycosylation pathway blocked in core oligosaccharide assembly in the yeast Pichia Pastoris: production of complex humanized glycoproteins with terminal galactoseP. Bobrowicz et al., Glycobiology 2004 • Use of combinatorial genetic libraries to humanize N-linked glycosylation in the yeast Pichia pastoris Choi et al., PNAS 2003 • Humanization of yeast to produce complex terminally sialylated glycoproteinsHamilton et al., Science 2006 • Glycosylation engineering in yeast: the advent of fully humanized yeast Hamilton et al., Current opinion in Biotechnology 2007