综合设计实验 Comprehensive experiment

1. 综合设计实验 Comprehensive experiment 山西地方南瓜种质资源的RAPD分析 Analysis on Genetic Variation of Pumpkin Resources in Shanxi

2. 实验原理 运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。 这种方法即为 RAPD (Random amplified polymorphic DNA ，随机扩增的多态性DNA)。 该技术建立于PCR技术基础上,它是利用一系列不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链为引物, 对所研究基因组DNA进行PCR扩增，聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离, 经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但对于任一特异的引物,它同基因组DNA序列有其特异的结合位点。这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件, 就可扩增出DNA片段。因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化, 而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。通过对PCR产物检测即可检出基因组DNA的多态性。分析时可用的引物数很大, 虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的, 但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组, 因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。另外，RAPD片段克隆后可作为RFLP的分子标记进行作图分析。

3. 主要内容 • 不同荞麦品种总DNA的提取； • 总DNA的电泳检测； • RAPD分析； • 电泳检测并进行统计分析；

4. 实验材料和试剂 实验材料：荞麦幼嫩叶子。 实验所需试剂： • 随机引物(10mer) (5μmol/L) 购买成品； • Taq 酶：购买成品； • 10×PCR 缓冲液； • MgCl2：25mmol/L； • dNTP：每种2.5mmol/L。

5. 实验仪器 PCR仪

6. 凝胶电泳仪和电泳槽

7. 凝胶成像系统

8. 实验步骤 1. 在25μL反应体系中,加入以下物质： 模板DNA 1μL (50ng) ；　　　　随机引物 1μL (约5pmol) ；10×PCR Buffer 2.5μL；MgCl2 2μL ；dNTP 2μL；Taq酶 1单位（U）； 　　　　加ddH2O 至 25μL； 混匀稍离心, 加一滴矿物油。

9. 2. 在加热至90℃以上的PCR仪中94℃预变性 2 分钟, 然 后循环: 94℃ 1分钟，38℃ 1分钟，72℃ 1 分钟，共40轮循环； 3. 循环结束后, 72℃ 10分钟，4℃保存； 4. 取PCR产物15μl加3μl上样缓冲液(6×)于2%琼脂糖胶 上电泳, 稳压50-100Ｖ（电压低带型整齐， 分辨率高） 5. 电泳结束，观察、拍照。

10. 典型的RAPD例图

12. mega2软件进行聚类分析 相似系数计算：s=[2Mxy/(Mx+My)]×100% s: 相似系数； Mxy: X品种和Y品种片段总和； Mx : X品种片段数；My: Y品种片段数 聚类例图

13. 注意事项 • EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,防止污染； • 加样品要更换tip头,以防止互相污染； • 制备凝胶时温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡； • 电泳时一般RAPD带有5-15条, 大小0.1-2.0kb；　　　　　 • 特异性的DNA带可以克隆作为一个新的分子标记应用。

14. 思考题 随机引物扩增，为什么会产生DNA双链产物 ？