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Tecniche cromatografiche

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Tecniche cromatografiche - PowerPoint PPT Presentation


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Tecniche cromatografiche. Schema a Blocchi di un Sistema Cromatografico. RIVELATORE. Valvola di ritegno a sfera. Pompa alternativa a pistone. Vantaggi: Robustezza Pressioni in uscita molto elevate (fino a 700 bar) Volume interno ridotto (50 µl) -> adatte all’utilizzo in gradiente

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Presentation Transcript
pompa alternativa a pistone

Valvola di ritegno a sfera

Pompa alternativa a pistone

Vantaggi:

  • Robustezza
  • Pressioni in uscita molto elevate (fino a 700 bar)
  • Volume interno ridotto (50 µl) -> adatte all’utilizzo in gradiente
  • Flussi costanti
valvole di iniezione
Valvole di iniezione

L’interfaccia universalmente utilizzata per introdurre il campione è la valvola a 6 (o 7) vie.

A seconda del loopmontato varia il volume del campione iniettato in colonna

high performance liquid chromatography hplc
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
  • Elevato numero di piatti teorici
  • Ridotta dimensione delle particelle di matrice
  • Elevata retropressione della colonna
colonne per hplc
Colonne per HPLC

Pressione fino a 55 MPa (550 Bar)

rivelatori
Rivelatori
  • Sensibilità adeguata al problema
  • Buona stabilità e riproducibilità
  • Risposta lineare al soluto, possibilmente per parecchi ordini di grandezza
  • Tempi di risposta rapidi
  • Risposta verso tutti i soluti, oppure risposta selettiva verso una o più classi di soluti
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Rivelatore a indice di rifrazione

Il rivelatore a indice di rifrazione misura la differenza nell’indice di rifrazione tra la cella del campione e una cella di riferimento che generalmente contiene soltanto l’eluente. Si utilizza un fascio di luce collimato e filtrato per rimuovere la luce IR che riscalderebbe il campione. Quando l’eluente contenente l’analita entra nella cella del campione, il raggio viene deflesso e inviato al fotodiodo producendo un segnale in uscita differente rispetto a quello prodotto dal solo eluente.

Vantaggi e svantaggi

È un rivelatore universale, cioè risponde a tutti i composti. Si utilizza per analiti che non assorbono in UV (es. idrocarburi saturi, alcool, eteri)

Svantaggi: è poco sensibile, non è compatibile con gradiente di eluizione ed è sensibile a variazioni di p e T.

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Rivelatore UV a l fissa

La radiazione proveniente da una lampada a vapori di Hg passa attraverso la cella del campione e arriva al fotodiodo.

L’intensità della luce assorbita è proporzionale alla concentrazione dell’analita.

Vantaggi e svantaggi

Il principale vantaggio è il basso costo. Inoltre l’elevata intensità della radiazione della lampada a Hg permette di ottenere elevata sensibilità per composti che assorbono a 254 nm.

Il principale svantaggio è determinato dalla scarsa selettività dovuta alla necessità di lavorare a l fissa.

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Il rivelatore UV a l variabile è sicuramente quello maggiormente utilizzato in HPLC.

La luce UV proveniente dalla lampada a D2 e scissa nelle sue componenti attraverso un monocromatore a gradini. L’intensità della luce trasmessa è misurata attraverso un fotodiodo ed è proporzionale alla concentrazione dell’analita

  • Vantaggi
  • Versatilità: possibilità di selezionare l da 190 a 800 nm.
  • Elevata sensibilità: potendo scegliere la l ottimale (max assorbanza) per un analita.
  • Selettività: quando si hanno sovrapposizioni di picchi si può variare la l in modo tale da minimizzare l’assorbimento degli interferenti.
  • Possibilità di utilizzare gradiente di eluizione, scegliendo una l alla quale la miscela solvente non assorbe.
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Rivelatore UV a diode array

Il rivelatore UV a l diode array è quello che attualmente viene sempre più utilizzato in HPLC.

La luce UV proveniente dalla lampada a D2 passa attraverso una cella a flusso prima che venga scissa nelle sue componenti attraverso un monocromatore a gradini. L’intensità della luce trasmessa ad ogni l è misurata simultaneamente attraverso un array di alcune centinaia di fotodiodi. Un pc può processare, registrare e mostrare gli spettri in continuo durante l’analisi. Inoltre si possono registrare i cromatogrammi a ciascuna l.

Vantaggi e svantaggi

Presenta gli stessi vantaggi in termini di versatilità, sensibilità e selettività del rivelatore a l variabile. Fornendo anche gli spettri degli analiti, permette di effettuare anche il riconoscimento dei composti analizzati.

Svantaggio: è più costoso rispetto al rivelatore a l variabile.

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Rivelatore a Fluorescenza

La luce UV proveniente da una lampada (filtrata alla opportuna λ) o da un laser, passa attraverso la cella a flusso. Quando un campione fluorescente passa attraverso la cella, assorbe la radiazione, viene eccitato e quindi emetterà la radiazione di fluorescenza ad una maggiore λ. L’intensità della luce emessa viene misurata attraverso un fotomoltiplicatore posto a 90° rispetto al fascio incidente.

Vantaggi e svantaggi

È un rivelatore molto sensibile, ma risponde soltanto ai pochi analiti fluorescenti. Per aumentarne l’applicabilità si possono legare covalentemente dei marker fluorescenti. Questa derivatizzazione può essere fatta o prima della separazione o post-colonna aggiungendo i reattivi marcanti tra la colonna e il rivelatore.

cromatografie di ripartizione
Cromatografie di ripartizione
  • Fase diretta (fase staz. polare, eluente apolare)
  • Fase inversa (fase staz. apolare, eluente polare)

Si – O – C18H37

gel filtrazione
Gel filtrazione
  • L’interazione avviene tra la proteina e la matrice polimerica.
  • La matrice polimerica è fatta di microsfere con porosità controllata.
  • Le proteine interagiscono con i pori delle microsfere e vengono trattenute in base alla loro dimensione.
  • Se una proteina, molto grande, non interagisce con la matrice esce con un volume di eluente pari al Void Volume (volume vuoto).
gel filtrazione19
Gel filtrazione
  • Vantaggi
    • Semplice
    • Prevedibile
  • Svantaggi
    • Bassa capacità (piccoli volumi)
    • Soluzioni non viscose
determinazione peso molecolare
Determinazione peso molecolare

Una proteina sconosciuta eluisce a 170 mL:

40,000 Da (40KDa)

cromatografie di adsorbimento
Cromatografie di adsorbimento
  • Interazione idrofobica
  • Scambio ionico
  • Per affinità
    • Affinità per ligandi (anticorpi)
    • Proteine ingegnerizzate (His-tag)
      • Immobilized Metal ion Affinity Chromatography
coefficiente di partizione a
Coefficiente di partizione - a
  • Il coefficiente di partizione tra le due fasi, a, è definito come il rapporto tra il soluto adsorbito sulla fase stazionaria rispetto a quello in soluzione nella fase mobile.

a = 0 nessun adsorbimento

a = 1 tutto adsorbito

cromatografia di scambio ionico
Cromatografia di scambio ionico
  • Scambio anionico
    • A pH maggiore del pI (almeno una unità) la proteina è carica negativamente e lega la colonna a scambio anionico.
    • L’eluizione avviene con [Cl-] crescente o abbassando il pH (più difficile da controllare).
  • Scambio cationico
    • A pH minore del pI (almeno una unità) la proteina è carica positivamente e lega la colonna a scambio cationico.
    • L’eluizione avviene con [Na+] crescente o alzando il pH.
cromatografia di scambio ionico29
VANTAGGI

Per grandi volumi,

Grandi quantità di proteina (1-5 g proteina per 100 ml),

Matrice molto robusta,

Condizioni molto flessibili, possibili molte variazioni.

SVANTAGGI

Proteine allo stesso pH e concentrazioni di sali della colonna.

Ciò può essere scomodo poiché poi occorre passare in dialisi per togliere i sali.

Cromatografia di scambio ionico