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Tecniche Cromatografiche

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Tecniche Cromatografiche - PowerPoint PPT Presentation


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Tecniche Cromatografiche. Seconda parte. Cromatografia per interazione idrofobica (HIC). È un tipo di cromatografia sviluppato per la purificazione di proteine, le separa sulla base della loro idrofobicità di superficie.

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Presentation Transcript
cromatografia per interazione idrofobica hic
Cromatografia per interazione idrofobica (HIC)
  • È un tipo di cromatografia sviluppato per la purificazione di proteine, le separa sulla base della loro idrofobicità di superficie.
  • I sali ad alta concentrazione riescono ad esporre le regioni idrofobiche, sottraendo le molecole d’ acqua ordinate
  • le proteine tendono così ad interagire fra loro (“salting out”). Nella HIC queste regioni così esposte tendono ad interagire con una fase stazionaria costituita da gruppi idrofobici.
  • È una cromatografia che è vantaggioso applicare ad esempio dopo il frazionamento con ammonio solfato.
  • L’eluizione può essere fatta con forza ionica decrescente oppure per “spiazzamento” con detergenti non ionici (Tween 20, Triton X-100).
  • Potenziali svantaggi:
    • in alcuni casi le condizioni di eluizione possono provocare denaturazione.
    • non è predicibile, può applicarsi bene ad alcune proteine ma non ad altre.
cromatografia di affinit
Cromatografia di affinità

Resina

Braccio spaziatore

Ligando

cromatografia di affinit7
Cromatografia di affinità
  • Un ligando ad alta affinità per la proteina è legato alla matrice
  • La proteina di interesse si lega al ligando e viene immobilizzata sulla colonna
  • Le altre proteine vengono “lavate” via.
  • La proteina di interesse viene eluita usando una soluzione di ligando.
cromatografia di affinit9
VANTAGGI

Alta affinità, costanti di dissociazione nell’ordine del mM, nM o anche pM.

Legame tutto o nulla:

Possibili molte variazioni (affinity tags)

SVANTAGGI

L’ingombro sterico spesso abbassa la capacità

Il braccio spaziatore può avere influenza sul legame

L’eluizione può richiedere un eluente specifico

Cromatografia di affinità
affinity tags
Gli affinity tags sono si ottengono attraverso la preparazione di proteine ricombinanti. Alla proteina di interesse è legato un tag che presenta affinità con un ligando:

TAG

GST

MBP

biotina

Poli-His

Proteina A

Affinity tags
  • LIGANDO
    • Glutatione
    • Maltosio
    • Avidina
    • Nichel, Zinco
    • Anticorpi
  • Le proteine contenenti affinity tags sono poi isolati per cromatografia di affinità con i ligandi legati alla colonna.
  • Le proteine isolate possono poi venire primate degli affinity tag attraverso proteolisi specifica.
obiettivi
Obiettivi:
  • Cattura
        • Isolare, concentrare e stabilizzare la proteina bersaglio
  • Purificazione intermedia
        • Eliminare la maggior parte dei contaminanti
  • Polishing
        • Ottenere la massima purezza possibile
slide19

AC: affinity chromatography

IEX: ion exchange

HIC: hydrophobic interaction chromatography

GF: gel filtration

RPC: reverse phase chromatography

slide22
Esempio: purificazione in due passaggi di una cellulasi. Cattura e purificazione intermedia mediante IEX
slide24

Cattura IEX su resina Q

  • Purificazione con HIC
  • Polishing per GF
gas cromatografia

Gas cromatografia

(Cromatografia di ripartizione gas-liquido)