基因重組原理與技術

1. 基因重組原理與技術 • 主講人: 陳建民 • 國立中山大學 • 生物科學系博士班

2. 基因重組的定義 • 基因重組一般又可稱為基因工程, 是利用分子生物學的方法, 將某一基因剪接到另一段DNA上, 並使之表現 • 人類第一個基因重組實驗 完成於1973年

3. DNA是遺傳物質

4. DNA構造

5. 染色體與DNA

6. 人類共有23對染色體

7. 染色體, 基因, 與DNA • DNA上有四種氮基 (A,T,C,G) 排成序列,每三個氮基構成一組密碼 • 若干個密碼可合組成一個有意義的序列,即稱為一個基因 • 一條染色體上有許多基因 (數百~數千) • 這些基因的共同表現即造成了一個生物體的外表特性

8. 何謂基因重組 (遺傳工程)? • 所有生物均有DNA作為遺傳物質 (一些病毒可以RNA作為遺傳物質) • 甲生物的DNA可以進入乙生物的細胞內並表現出遺傳特徵 • 用人為的方法將某基因剪切下來並植入其他生物細胞內, 以求新遺傳特徵表現的方法就稱為基因重組 (遺傳工程)

9. DNA的切割 • 通常 DNA 可以被核酸限制脢 (酉每) 切割 • 不同的核酸限制脢所切割的位置也不相同 • 通常辨識 4~6 個氮基序列(palindrome 序列) • 基因重組實驗時, 可按需要選取適當的核酸限制脢來進行 • 大多數的核酸限制脢, 是萃取自細菌 • 目前市面上可以買到上百種的核酸限制脢

10. DNA的切割 核酸限制脢的切割舉例

11. DNA的切割 核酸限制脢的切割舉例 – 以 BamH1 為例

12. 各種不同的核酸限制脢及其切割位置

13. 基因重組

14. 基因重組

15. 膠體電泳原理Gel Electrophoresis

16. DNA 膠體電泳裝置

17. DNA 膠體電泳步驟

18. 各種DNA 電泳膠體的染色

19. DNA 膠體電泳觀察與分析

20. DNA 轉形 (DNA Transformation) • 將 DNA 導入細胞內並完成重組的過程 • DNA 轉形方法: 1. 以 CaCl2 處理細胞 2. 電穿孔法 (electroporation) 3. 顯微注射法 (microinjection) 4. 微脂粒法 (liposome) 5. 利用病毒 (virus) 導入 6. 基因槍 (biolistics, gene gun, microprojectile bombardment,)

21. DNA 轉形 (DNA Transformation) 以 CaCl2 處理, 製造 compentent cell

22. DNA 轉形 (DNA Transformation) 電穿孔法 (electroporation)

23. DNA 轉形 (DNA Transformation) 電穿孔法 (electroporation)

24. DNA 轉形 (DNA Transformation) 顯微注射法 (microinjection)

25. DNA 轉形 (DNA Transformation) 微脂粒傳送法 (liposome transfer)

26. DNA 轉形 (DNA Transformation) 病毒載體轉殖 (virus vector) 1. 以病毒感染細胞的方式, 將所欲植入的基因攜入目標細胞內 2. 常使用的病毒載體: a. 反轉錄病毒 (Retrovirus) – 可攜帶 8 kb b. 腺病毒 (Adenovirus) – 可攜帶 8~10 kb c. 皰疹病毒 (Herpesvirus) – 可攜帶 30 kb

27. 基因轉形 (DNA transformation) 基因槍 (Microinjectile Bombardment, Biolistics, Gene Gun)

28. 基因轉形 (DNA transformation) 基因槍 (Microinjectile Bombardment, Biolistics, Gene Gun) 1. 將 DNA 黏附在黃金或鎢質的“子彈”上, 以高壓氣體快速射入目標細胞內 2. 子彈速度高達 1760 公里 / 小時 3. 可穿透植物細胞壁

29. 轉殖載體 (Cloning Vectors) • 細菌 – 質體 (plasmids) 噬菌體 (bacteriophages) 黏接質體 (cosmids) • 植物 – Ti 質體　(Ti plasmid) • 哺乳類細胞 – SV40 病毒 反轉錄病毒 (retrovirus) 腺病毒 (adenovirus) 皰疹病毒 (herpesvirus) • 其他 – 人造酵母染色體 YACs (yeast artificial chromosomes)

30. 轉殖載體 (Cloning Vectors) 質體 (plasmids) • 細菌細胞內除了具有一個環狀的染色體外, 尚可具有一些小環狀的DNA, 稱為質體 • 質體上也具有基因, 可使細菌具備一些額外的功能 • 質體可以分離出來, 作為遺傳工程用的基因載體

31. 轉殖載體 (Cloning Vectors) 質體 (plasmids)

32. 轉殖載體 (Cloning Vectors) 質體 (plasmids) 舉例 1. 複製起始點 2. 篩選標記基因 – 通常為抗藥基因 3. 核酸限制脢切割位置

33. 轉殖載體 (Cloning Vectors) 噬菌體與 cosmids 舉例

34. 轉殖載體 (Cloning Vectors) 植物基因轉殖與 Ti 質體

35. 轉殖載體 (Cloning Vectors) 植物基因轉殖與 Ti 質體

36. 轉殖載體 (Cloning Vectors) 植物基因轉殖與 Ti 質體

37. 轉殖菸草

38. 轉殖載體 (Cloning Vectors) 反轉錄病毒與動物基因轉殖

39. 轉殖載體 (Cloning Vectors) 人造酵母染色體 YACs (yeast artificial chromosomes)

40. 轉殖載體 (Cloning Vectors) 人造酵母染色體 YACs (yeast artificial chromosomes)

41. DNA Library的建立與特定基因之篩選 • 將某一生物之基因組 (genome) 切碎, 將所有 DNA 碎片選殖到載體上並植入宿主細胞內, 此種組合便稱為該生物的 DNA library • 爾後便可用 DNA 探針 (DNA probe) 自 DNA library 中篩選特定基因, 進行研究

42. DNA Library的建立與特定基因之篩選

43. DNA Library的建立與特定基因之篩選 以探針篩選特定基因 DNA 探針

44. DNA Library DNA library 通常可區分為 genomic library及 cDNA library二種

45. Genomic DNA Library • Genomic library 是將某一生物之完整基因組 (genome) 切碎, 將所有 DNA 碎片選殖到載體上並植入宿主細胞內 • 通常以大腸桿菌 (E. coli) 為宿主 • 選用的載體可為各種質體cosmids 或噬菌體

46. cDNA Library • 某些生物 (例如動物或植物) 的基因組太大, 不適合做 genomic library • 因此可針對一些特定組織的表現基因來做 library 即可 • cDNA library 即是將某一特定組織的 mRNA萃取出來, 以反轉錄方式做出 cDNA • 將 cDNA 選殖到載體上並植入宿主細胞, 即成為 cDNA library

47. cDNA 製作方法

48. cDNA Library 的特色 • cDNA library 中的基因不含有intron 序列 • cDNA library 中的基因均不含有基因調節因子 (regulatory elements), 例如 promoters 及 enhancers 等, 基因重組時可以另外自由選用合適的 promoter • cDNA library 比 genomic library 大為精簡許多

49. 真核基因內的 Intron 序列

50. 真核基因內的 Intron 序列