1 / 27

指導教授：吳文海 教授 研 究 生：黃柏智 報告日期： 2009/11/25

指導教授：吳文海 教授 研 究 生：黃柏智 報告日期： 2009/11/25. 大綱. 前言 實驗藥品 實驗步驟 結果與討論 結論. 前言. Liposome 是脂質空心微球 ， 懸浮於水相中 。 磷脂分子之磷酸端為親水性 ， 脂質端為疏水性 ， 由此所形成的脂質層雙面為親水 ， 內層為疏水膜 。 水溶性物質 ( 藥物 ) 可包在球心之溶液 ， 油溶性物質可夾在球皮膜層中 ， 由此 Liposome 可當作水性物質及油性物質之載體 。. 親水區域. 疏水區域. Liposome 立體示意圖. 藥物載體的特性. 做為一個良好之藥物載體必須具備以下特性 :

clarke-burch
Download Presentation

指導教授：吳文海 教授 研 究 生：黃柏智 報告日期： 2009/11/25

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. 指導教授：吳文海 教授 研 究 生：黃柏智 報告日期：2009/11/25

  2. 大綱 • 前言 • 實驗藥品 • 實驗步驟 • 結果與討論 • 結論

  3. 前言 • Liposome是脂質空心微球，懸浮於水相中。 • 磷脂分子之磷酸端為親水性，脂質端為疏水性，由此所形成的脂質層雙面為親水，內層為疏水膜。 • 水溶性物質(藥物)可包在球心之溶液，油溶性物質可夾在球皮膜層中，由此Liposome可當作水性物質及油性物質之載體。 親水區域 疏水區域 Liposome立體示意圖

  4. 藥物載體的特性 做為一個良好之藥物載體必須具備以下特性 : 1.較小之粒徑以通過血管壁間隙進入細胞 2.低藥物洩漏率 3.可長時間在體內循環 4.高度的細胞選擇性(對癌細胞的選擇性) 這些特性可由Liposome下列組成來達到: 1.HSPC:Liposome的主要組成成份，其所形成之單層 Liposome其粒徑約為123.8nm(腫瘤血管壁間隙約 500nm) 。 2.膽固醇 :膽固醇能幫助膜結構的黏合，同時減緩膜滲透的速 率，降低藥物洩漏率。 3.DSPE-PEG:PEG的長鏈可以增加Liposome周圍的立體障礙，防 止血液中的抗體辨識Liposome，增加Liposome在體 內的循環時間 。 4.RGD:RGD胜肽對癌症血管內皮細胞上的αvβ3 細胞受體 有高度專一結合性，增加Liposome對癌細胞的選擇性。

  5. LCL結合RGD胜肽 RGD-LCL DSPE-PEG-Mal與RGD結合 RGD上的硫醇基在室溫以及pH6.5-7.5下與 Maleimide 結合 RGD-LCL : RGD-長效性微脂體 (LCL:Long circulating liposomes) 膽固醇在脂質層的排列方式

  6. 藥物的作用機制 =RGD-LCL RGD-LCL通過血管間隙，與腫瘤內皮細胞上的αvβ3受體結合，釋放出Combretastatin A4藥物破壞腫瘤血管細胞之吸收，使腫瘤無法得到養分。

  7. 實驗藥品 • Hydrogenated soybean phosphatidylcholine (HSPC) 氫化大豆卵磷脂 • 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phospho- ethanolamine-N-[Polyethylene glycol] (DSPE-PEG) 二硬脂酸磷酸脂乙醇胺氮聚乙二醇

  8. 實驗藥品 • 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phospho- ethanolamine-N-[ Maleimide Polyethylene glycol] ( DSPE-PEG-Maleimide) • Cholesterol 膽固醇

  9. 實驗藥品 • Combretastatin A4 • cyclo [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys](RGD 胜肽) • cholesteryl [4-14C]oleate 油酸膽固醇酯[碳-14]

  10. 實驗步驟(LCL) HSPC :325μmol Cholesterol :150μmol DSPE-PEG :25 μmol Drug :100μmol 混合 溶解於chloroform : methanol (9:1 vol:vol)溶液中 旋轉蒸發法去除溶劑 形成脂質薄膜 溶於 50mM HEPES +150mM Nacl buffer(pH6.5)中 擠壓Liposome通過小孔徑 PC膜，使多層Liposome破裂 重組成單層Liposome 形成多層Liposome 與 50mM HEPES +150mM Nacl buffer(pH6.5) 在62℃進行水合2小時

  11. 實驗步驟(RGD-LCL) HSPC :325 μmol Cholesterol :150 μmol DSPE-PEG :24.5μmol DSPE-PEG-Mal:0.5 μmol Drug :100 μmol 由上述方法製備出單層Liposome 加入0.1ml 之0.27 mol RGD (溶於PH 6.5之50mMHEPES buffer) 在室溫靜置12小時，反應生成 RGD-LCL

  12. 結果與討論 RGD 游離之RGDpeak落在14min的位置 RGD-LCL 只有Liposome的peak代表RGD全部與Liposome上之 Maleimide 結合 RGD-LCL 過量RGD+RGD-LCL 有Liposome和RGD的peak代表RGD與Maleimide之鍵結已飽和 由此可證實RGD與LCL結合

  13. 觀測Liposome形狀及粒徑 粒徑約為123.8nm 粒徑約為3~7μm 由光學顯微鏡及TEM來觀察多層Liposome及單層Liposome

  14. 動態光散射法測定粒徑 可使用動態光散射法測定Liposome 的平均粒徑及分佈 可由粒徑判斷經過擠壓後之 Liposome 為多層Liposome或單層Liposome ，以及粒徑之分布情形。

  15. Liposome配方改變的影響 改變 Liposome 成分之比率、濃度以及藥物和脂質的比率，探討Combretastatin A4的濃度及包覆率。

  16. Liposome配方改變的影響

  17. Liposome配方改變的影響 • 上述表格顯示最好的配方為Ｄ，其次為Ｇ、Ｆ、Ｃ。 • Ｇ的配方由於所需 Liposome 濃度較高 （2倍），成本較高 ， • 且包覆藥物濃度並未顯著增加 (約為C的1.36倍) ，故不予考 • 慮。

  18. 體外藥物洩漏率測試 • 左圖顯示：在４８小時 • 後Ｆ以及Ｄ的包覆率低 • 於８０％ ，同時有下降 • 的趨勢。而Ｃ之 LCL 及 • RGD–LCL均在80%以上 • 並且下降趨勢不明顯， • 符合Liposome 需在體內 • 長時間循環之要求。 • 由上表及左圖的結果判斷 : • C為Liposome最佳化配方。 • (C =HSPC:Chol:DPSE- • PEG=65:30:5 ，濃度 • 100mM，藥物:脂質之莫 • 耳比率為20:100) 藥物包覆率

  19. Liposome與細胞結合率 1120 IL-1β為一種信號分子，可促進發炎反應使細胞表現αvβ3-integrinreceptor(一種細胞受體(cell adhesion receptor，對RGD有高度專一結合性) 。 800 580 310 RGD-LCL結合量約為LCL的四倍! 以油酸膽固醇酯[碳-14]進行放射標誌 放射性越高代表細胞結合之Liposme越多

  20. LiposomeV.S. 細胞 : 擴散 or 內吞 加入 Trypsin 破壞LCL 與細胞之間的結合 1.6:1 LCL 擴散 3:1 離心 LCL+細胞 2:1 3:1 細胞 內吞 若Liposome黏附於細胞表面，擴散傳播較易發生。 若Liposome連接於細胞受體上，內吞及擴散傳播發生比率接近。

  21. 加入過量RGD對細胞結合的影響 = αvβ3 細胞受體 加入過量RGD證實Liposome主要是由RGD與αvβ3受體之作用結合 =RGD-LCL =RGD IL-1β細胞 IL-1β細胞 RGD-LCL RGD-LCL+ FreeRGD

  22. 結論 • RGD-LCL對腫瘤血管細胞之結合，主要是由 RGD對αvβ3細胞受體作用而結合。 • RGD-LCL相對LCL來說，對腫瘤血管細胞有高度 選擇性，可以減少對正常細胞的傷害並提高治療 效率。 • RGD-LCL包覆藥物濃度最高可以達到2.99 mg/ • ml，而成本效益比最佳的RGD-LCL藥物濃度為 • 1.55mg/ml，可因應不同情況來選擇藥物濃度。

  23. 謝謝各位的聆聽

  24. 旋轉蒸發儀 持續旋轉使脂質形成均勻薄膜 接真空幫浦 收集溶劑 恆溫水槽

  25. 微孔擠壓機 加入Liposome懸浮溶液 通入氮氣給予壓力 通過小孔徑的PC(polycarbonate)膜過濾 膜的孔徑分別為0.8、0.4、0.2、0.1μm 擠壓後的Liposome溶液流出

  26. Liposome的合成 溶於非極性溶劑 溶於含有藥物的極性溶液並給予能量(震盪、超音波等等…) 用旋轉蒸發儀將溶劑蒸發，使其在圓底燒瓶上形成均勻的脂質膜。

  27. Liposome的藥物傳播 Liposome的藥物傳播藉內吞作用以及擴散作用來傳送到細胞內部。 擴散作用(diffusion) 內吞作用(Uptake)

More Related