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Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos

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  1. Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidosExtração de ácidos nucléicos • Obtenção do material: • Vírus • Bactérias; fungos • Célula vegetal / célula animal

  2. Extração de ácidos nucléicos Requerimento essencial: • quantidade (rendimento) • pureza • integridade Etapas na obtenção de ácidos nucléicos: • Lise física ou bioquímica das paredes celulares e membranas • Purificação dos ácidos nucléicos: desnaturação / inativação de proteínas celulares • Precipitação

  3. Extração de ácidos nucléicos 1. Rompendo membranas celulares Lise das células  liberação dos componentes citoplasmáticos e/ou nucleares Estratégia: de acordo com o tipo de célula envolvida: (deve ser o mais “gentil” possível) - bactérias (parede glicoproteica)  tratamento inicial com lisozimas (orifícios na parede  enfraquecimento  rompimento em solução hipotônica); outras soluções alternativas: temperatura elevada; sonificação

  4. Extração de ácidos nucléicos Células de plantas ou animais presentes em tecidos: • Pré tratamentos adicionais para romper a matriz tecidual  célula individual  lise: digestão enzimática / homogeneização • Célula vegetal – parede celular: tratamento mecânico para promover lise.

  5. Extração de ácidos nucléicos Células sem cobertura externa ou em solução: Sem tratamentos agressivos – tratamento com detergente – SDS (SODIUM DODECYL SULFATE) – dodecil sulfato de sódio  substâncias tensoativas que agem dissociando as proteínas dos ácidos nucleicos e dissolvendo proteínas de membranas solução de lise: NH4Cl / NH4HCO3

  6. 2. Desnaturando proteínas celulares: Lisados celulares contêm mistura complexa de macromoléculas: - DNA / RNA; proteínas, lipídeos, carboidratos. • Fragmentos de membrana lipídica • Proteínas intracelulares: enzimas nucleases degradativas – DNAses / RNAses  interferem no rendimento dos ácidos nucléicos Melhora na recuperação dos ácidos nucléicos: • Extração em baixas temperaturas • Incubação dos lisados com reagentes desnaturan- tes de proteínas • Agentes que retardam atividade das nucleases:

  7. Extração de ácidos nucléicos Agentes que retardam atividade das nucleases: • tampões de extração com agentes quelantes (EDTA – ácido etileno diaminotetracético) • Solução de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico  desnaturam nucleases e coagulam proteínas durante a extração • RNA- inibir Rnases (proteinase K; DEPC – dietil pirocarbonato )

  8. Extração de ácidos nucléicos 3. Separando DNA / RNA / Proteínas Extração por solventes - precipitação e/ou centrifugação Extração com fenol – solvente orgânico; desnatura proteínas; permite isolamento de DNA e proteínas (emprega solubilidade diferencial de proteínas, lipídios e ácidos nucleicos no fenol) Após centrifugação do lisado / mistura com fenol: 3 fases: aquosa (ácidos nucleicos) interface: proteínas camada do fenol

  9. Após centrifugação do lisado / mistura com fenol: Extração de DNA (fenol com pH neutro ou básico) 3 fases: aquosa (ácidos nucléicos: DNA e RNA) interface: proteínas camada do fenol Camada aquosa Camada de proteínas Camada do fenol pH neutro ou básico pH

  10. Após centrifugação do lisado / mistura com fenol: Extração de RNA (fenol com pH ácido) 3 fases: aquosa (RNA) interface: proteínas camada do fenol (DNA) Camada aquosa Camada de proteínas Camada do fenol pH ácido pH

  11. Extração de ácidos nucléicos 4. Precipitação e lavagem com álcool DNA: Ressuspender DNA em TE pH 8,0 – (Tris-HCl / EDTA), até completa dissolução – Armazenar a 4ºC  -20º C DNA precipitado

  12. Extração de ácidos nucléicos 4. Precipitação e lavagem com álcool RNA: Ressuspender RNA em água estéril (DEPC) – incubar à 55 – 65ºC por 10 minutos (inativar RNAse) – armazenar `a -80ºC RNA precipitado

  13. Extração de ácidos nucléicos com fenol RNA DNA Camada aquosa (RNA) Interface (proteínas) Camada de fenol (DNA) Fenol pH ácido Fenol pH neutro/alc. DNA pptado RNA pptado

  14. Extração de ácidos nucléicos a partir de sangue total

  15. Extração de ácidos nucléicos

  16. Extração de ácidos nucléicos

  17. Gel de agarose 1% com 3 ml de DNA genômico M 1 2 3 M - Marcador 1, 2 e 3 - amostras de DNA genômico

  18. Extração de ácidos nucléicos • Soluções utilizadas • tampão de extração • solução de lise • solução desnaturante de proteínas • fenol • clorofórmio • Etanol • Proteinase K

  19. Extração de ácidos nucleicosFunção dos reagentes • Tampão: proporciona um pH ideal para manutenção da integridade das moléculas de ácidos nucléicos; inibem atividade de desoxirribonuclease; ex.: TE - pH 8,0 (Tris-HCl / EDTA – ácido etilenodiamino tetracético). • Detergentes: substâncias tensoativas que agem dissociando as proteínas dos ácidos nucléicos e dissolvendo os lipídios de membrana; SDS =sodium dodecyl sulfate. • Fenol: desnatura proteínas, permitindo o isolamento de DNA/RNA de amostras biológicas.

  20. Extração de ácidos nucléicosFunção dos reagentes • Clorofórmio: desnatura proteínas aumentando a eficiência da extração de ácidos nucléicos. • Inibidores de nucleases: quelante de Mg++(EDTA) DEPC – dietil pirocarbonato). • Etanol: induz alterações estruturais nas moléculas de ácidos nucléicos provocando a agregação das moléculas, seguida de precipitação (remove resíduos de fenol e clorofórmio). • Proteinase K – a contaminação com proteínas pode ser removida pela digestão com proteinase K