水稻 rbcS 基因启动子的克隆及结构功能分析

水稻rbcS基因启动子的克隆及结构功能分析 报告人：王宏建

主要内容 • 1、背景知识介绍 • 2、实验材料和方法 • 3、实验结果 • 4、讨论

1、背景知识介绍 • rbcS基因启动子是研究较多的一种启动子,自1980年从豌豆cDNA库中克隆了第1个小亚基基因(rbcS)开始，相继在大豆、拟南芥、烟草等植物中克隆了rbcS基因，研究表明它具有光诱导性同时也具有组织特异性。(Marzábal etal.,2000)。

1、背景知识介绍 • 由于组成型启动子在应用中逐渐暴露出一些问题，例如外源基因在整株植物中表达，产生大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累，打破了植物原有的代谢平衡。 • 因此，人们寻找更为有效的组织、器官特异性启动子代替组成型启动子，以更好地调控植物基因表达。

1、背景知识介绍 • 目前人们已分离鉴定了一批特异性启动子。 • 如病原诱导启动子、光诱导表达启动子等诱导型启动子；韧皮部特异性启动子、花特异性启动子等组织特异性启动子。 • 这些特异性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。

1、背景知识介绍 • 研究启动子结构和功能的方法主要是启动子缺失。缺失分析是确认启动子序列上功能元件的一种十分重要且有用的方法。 • 这种方法是通过启动子酶切或PCR方式获得启动子5 '端或3 '端不同缺失大小的片段，然后将这些片段与报告基因连接构建成融合基因。 • 转化受体后检测报告基因的表达模式，从而确定启动子的一些功能元件。

1、背景知识介绍 • 凝胶阻滞试验（gel retardation assay），又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay），是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点，也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。

1、背景知识介绍 • 凝胶阻滞试验的原理：在凝胶电泳中，由于电场的作用，小分子DNA片段比其结合了蛋白质的DNA片段向阳极移动的速度快，因此，可标记短的双链DNA片段，将其与蛋白质混合，对混合物进行凝胶电泳。 • 若目的DNA与特异性蛋白质结合，其向阳极移动的速度受到阻滞，对凝胶进行放射性自显影，就可找到DNA结合蛋白。

1、背景知识介绍 • 由于其特异性好，凝胶阻滞试验常用来鉴定其他方法筛选出的结果，显而易见，克隆启动子DNA片段并标记，用该实验就可找到相应的结合蛋白。

1、背景知识介绍 • 本实验旨在克隆水稻OsrbcS基因的5'上游调控区序列并对其进行结构和功能分析，期望其在绿色组织特异表达，为转基因育种提供目标表达启动子。

2、实验材料与方法 • 2.1 实验材料 • 粳稻品种中花11种子，大肠杆菌菌株DH5α，根癌农杆菌菌株EHA105，载体pCAMBIA1301。

2.2 实验方法 2.2.1 目的基因序列克隆及植物表达载体构建 2.2.2 Posrbcs启动子不同长度缺失体的获得及植物表达载体的构建 2.2.3 农杆菌介导的水稻遗传转化及转基因植株的阳性检测 2.2.4 GUS组织化学分析 2.2.5 GUS定量检测 2.2.6 转基因植株 T1代幼苗光诱导表达GUS活性检测 2.2.7 核蛋白提取 2.2.8 凝胶阻滞

2.2.1 目的基因序列克隆及植物表达载体构建 p-F1:5‘-CGGGAGCTCTCGGGTCGAGGTGAACTTTA-3’； p-R1:5'-CATGCCATGGAGATGCACTGCTCTGCACAC-3'。 • 根据生物信息学分析，粳稻日本晴的Osrbcs基因位于第12染色体，BAC克隆号为OSJN-Ba0056I18，分析结果显示，基因上游1.5 kb为启动子区。 • 利用本实验室的日本晴BAC文库，抽取质粒为模板，设计引物，进行PCR扩增目标片段。 • 目的片段命名为Posrbcs，长1619 bp 。

2.2.1 目的基因序列克隆及植物表达载体构建 pCAMBIA1301含GUS基因和潮霉素抗性基因(hygr) • 在p-F1 5 '端引入SacⅠ酶切位点，p-R1 5'端引入NcoⅠ酶切位点。用SacⅠ/NcoⅠ酶切扩增的目标片段Posrbcs ，纯化。 • 同样用SacⅠ/NcoⅠ处理pCAMBI-A1301，切除启动GUS基因表达的35S启动子；与纯化的Posrbcs连接，构建植物表达载体，命名为p1301r。

2.2.2 Posrbcs启动子不同长度缺失体的获得 及植物表达载体的构建 • 根据获得的Posrbcs序列设计引物 • 在p-F 5 '端引入SacⅠ酶切位点，p-R 5'端引入NcoⅠ酶切位点。 • PCR扩增获得Os1320、Os941、Os550、Os344和Os62 5个启动子5 '端缺失体。载体构建过程同2.2.1。 • 载体分别命名为pOs1320、pOs941、pOs550、pOs344和pOs62。长度分别为:1319、940、550、344和62bp p-F1320:5'-CGGGAGCTCCGGTAAGGATGGGATGGTAG-3'; p-F941:5'-CGGGAGCTCAACCTCAAACGGAGGGAGTA-3'; p-F550:5'-CGGGAGCTCGCTTAATGAGGGCCCAAAG-3'; p-F344:5'-CGGGAGCTCGCAGAGGGAGACAAAGGTGA-3'; p-F62:5'-CGGGAGCTCGATCCGCTGAGTTTTGGCTA-3'; p-R:5'-CATGCCATGGAGATGCACTGCTCTGCACAC-3'。

2.2.3 农杆菌介导的水稻遗传转化及转基因植株的阳性检测 • 利用电转化的方法将构建好的植物表达载体转入根癌农杆菌菌株EHA105，然后侵染粳稻品种中花11成熟种子诱导的胚性愈伤组织。共培养后用50 mg/L潮霉素筛选。

2.2.3 农杆菌介导的水稻遗传转化及转基因植株的阳性检测 • p1301r、pOs1320、pOs941、pOs550、pOs344和pOs62相应的转化植株命名为1301r、OS1320、OS941、OS550、OS344和OS62。 • 所得植株用PCR法进行阳性检测,引物均为GUS基因内部引物。 gus-F:5'-GGGCGAACAGTTCCTGATTA-3'; gus-R:5'-CGAAATATTCCCGTGCACTT-3'。

2.2.4 GUS组织化学分析 • 每个构建体分别取10株阳性转基因植株的叶片、茎杆、叶鞘、颖壳和花、种子，切成适当大小，浸入适量的GUS染液中，37℃过夜；然后用75%酒精脱色，观察。

2.2.5 GUS定量检测 • 参考Jefferson et al.(1987)的方法，用Bradford(1976)法测定蛋白浓度。 • 每个构建体分别取10株阳性转基因植株的叶、叶鞘、茎杆和颖壳，用液氮磨成粉末，取约100 mg粉末加入500μL GUS蛋白提取液，混匀后离心取上清，加入反应底物4-MUG（ 4-甲基伞形酮-β –D-葡萄糖醛酸苷），37℃反应1 h，用荧光分光光度计测定生成的4-MU（4-甲基伞形酮）的浓度。

2.2.5 GUS定量检测 • GUS活性以MU的皮摩尔数与总蛋白含量及时间的比值pmol4-MU/μg protein/min表示。

2.2.6 转基因植株 T1代幼苗光诱导表达GUS活性检测 • 将1301r、Os1320、Os941、Os550、Os344和Os62 T1代种子在暗培养室培养10 d，各株系分别取10棵幼苗的叶片混合取样抽提GUS蛋白。 • 然后在光培养室培养，在12、24和48 h时各株系分别混合取样，抽提GUS蛋白,再进行GUS定量分析。测定方法同2.2.5。

2.2.7核蛋白提取 • 参照Marz balet al.(1998)年的方法，材料用液氮磨成粉末。加入匀浆缓冲液，搅拌混匀，用纱布及miracloth过滤，离心。 • 倒上清，沉淀用低盐缓冲液重悬，离心。倒上清，加入1/2沉淀体积的高盐缓冲液，震荡器上低温震荡离心，吸上清，透析。

2.2.8 凝胶阻滞 • 根据对Posrbcs序列的顺式作用元件的分析结果，人工合成含相应顺式元件的DNA双链探针部分序列。 • 将合成的DNA片断用Klenow酶进行末端标记制成探针，与10μg核蛋白进行结合反应，室温反应20 min。 • 反应后的样品用5%非变性PAGE胶电泳。电泳完毕后，用滤纸将胶粘下，保鲜膜封好后，X光片压3 h。

2.2.8 凝胶阻滞 Q3:5'-TAAATGCCCAAATAGGGTTTCAGAAAGTTCAAAAGT-3'; Q5:5'-AGTTGGAAAAAAGATAAGTACGCTGAGAGAGGTCGGGGATCGAATTCTG-3'; Q11:5'-TCCCTTTGTTTCAGATTATAATATGTTTTGACTTTGGTTAATATCAAAC-3'; Q14:5'-TATTTTCATAATAAATTTGTGTTGTGTTGAAAATATTATTAACTTTTTC-3'; Q15:5'-TTTTCTACAAACTTGGTTAAACTTGAAGCAGTTTGACTTTGACCAAAGT-3'; Q19:5'-GCTTCTAAATGTTTAATTGGGAAAATGTCGAATGACAAATTAATATTTT-3'; Q25:5'-ATAAAGATGCTTTGCTTAATGAGGGCCCAAAGTTTTGATGACCTTTTGC-3'; Q29:5'-ATTGATCACAAAAGAAACCAAAATAAAAATCAGCACCGAGTGTGCAGAG-3'; Q33:5'-AGATGCCACCACGGCCACAATCCACGAGCCCGGCGCGACACCACCGCGC-3'; Q34:5'CGCGCGCGCGTGAGCCAGCCACAAACGCCCGCGGATAGGCGCGCGCACG3'。

3、实验结果 3.1 表达载体的转化 3.2 1301a及1301r植株PCR阳性检测 3.3 1301a及1301r阳性植株GUS组织化学分析及GUS定量检测 3.4 不同长度Posrbcs缺失体转化植株的GUS组织化学分析 3.5 不同长度Posrbcs缺失启动子转化植株的GUS定量检测 3.6 不同长度Posrbcs缺失启动子转化植株经光诱导后GUS基因的表达 3.7 Posrbcs启动子序列凝胶阻滞分析

3.1 表达载体的转化 • 参照本实验室粳稻遗传转化方法，对中花11进行了遗传转化，抗性愈伤组织率在30%左右，分别获得1301r、OS1320、OS941、OS550、OS344和OS62独立转化植株30、21、21、22、20和20株。

3.1 表达载体的转化 • 另外,为了比较内源和外源的rbcs基因启动子在水稻中是否存在表达差异，我们从拟南芥中分离了rbcs1A启动子，与GUS基因融合构建表达载体，命名为p1301a，同时转化中花11，结果获得30个独立转化植株。

3.2 1301a及1301r植株PCR阳性检测 • 对转化再生植株(T0)进行PCR检测，根据结果剔除阴性植株。 • 根据GUS基因内部序列设计引物，PCR扩增目标片段为450 bp。

3.3 1301a及1301r阳性植株GUS组织化学分析及GUS定量检测 • 取1301a及1301r阳性植株根、茎、叶、叶鞘、颖壳、花和种子进行GUS组织化学染色，观察这2个不同物种来源的启动子驱动GUS基因在水稻中表达的差异。

3.3 1301a及1301r阳性植株GUS组织化学分析及GUS定量检测染色结果显示，GUS基因在1301r植株叶、茎、叶鞘、颖壳及幼胚中表达，在胚乳中不表达；而GUS基因在1301a植株的叶、叶鞘中表达，在茎、颖壳和幼胚中均不表达。初步推测不同物种来源的rbcs基因启动子在水稻中对基因的调控方式有所不同。

3.3 1301a及1301r阳性植株GUS组织化学分析及GUS定量检测 • 分别对1301a和1301r植株分组织混合取样，抽提GUS蛋白后进行定量分析。结果如图所示。

3.3 1301a及1301r阳性植株GUS组织化学分析及GUS定量检测 • 说明拟南芥来源的rbcS基因启动子相对于水稻内源rbcS基因启动子在水稻组织中的启动表达强度要弱。

3.4 不同长度Posrbcs缺失体转化植株的GUS组织化学分析 • 在pOs62、pOs344、pOs550、pOs941和pOs1320侵染水稻中花11愈伤组织后,挑选部分愈伤组织进行GUS组织化学染色。 • 结果表明，这5种不同长度Posrbcs缺失启动子都能驱动GUS基因的表达，染色结果见图。

3.4 不同长度Posrbcs缺失体转化植株的GUS组织化学分析 • 分别取OS62、OS344、OS550、OS941和OS1320植株的叶片、叶鞘、茎杆、颖壳、花和胚乳进行GUS组织化学染色。 • 结果如图所示。

3.4 不同长度Posrbcs缺失体转化植株的GUS组织化学分析 • OS1320、OS941、OS550和OS344植株除在胚乳中不表达外,其它组织中均有有GUS活性。 • OS62在叶片、叶鞘和花中有GUS活性,但在茎杆和胚乳中不表达。

3.5不同长度Posrbcs缺失启动子转化植株的GUS定量检测3.5不同长度Posrbcs缺失启动子转化植株的GUS定量检测 • 为了研究由不同缺失长度的Posrbcs启动子驱动的GUS基因在转化植株中表达情况，对其进行GUS活性定量分析，结果如图。

3.5不同长度Posrbcs缺失启动子转化植株的GUS定量检测3.5不同长度Posrbcs缺失启动子转化植株的GUS定量检测 • 从图可以看出，随着启动子片段的缩短，GUS在各组织中的活性随之下降，说明在这些缺失片断中存在某些正调控元件，增强启动子的活性。 • 结果还显示，GUS在各组织间的表达活性也存在差异，在叶片中表达最强，茎杆中表达相对较弱，胚乳中几乎没有表达，说明在这些缺失片段中还存在某些组织特异性表达元件。

3.6不同长度Posrbcs缺失启动子转化植株经光诱导后GUS基因的表达3.6不同长度Posrbcs缺失启动子转化植株经光诱导后GUS基因的表达 • 为探明本实验克隆的Posrbcs启动子光诱导特性，根据方法2.6对六种转基因植株 T1代幼苗进行光诱导处理。 • 每个株系随机取10株幼苗混合抽提GUS蛋白，然后进行GUS定量检测,结果如图。

3.7 Posrbcs启动子序列凝胶阻滞分析 • 根据实验方法2.2.7和2.2.8，对Posrbcs序列中的人工合成片断进行凝胶阻滞实验，结果如图。

水稻 rbcS 基因启动子的克隆及结构功能分析