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2008 级五年制本科生 免疫学实验课

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2008 级五年制本科生 免疫学实验课. 补体依赖细胞毒试验. 实验内容. 补体依赖的细胞毒试验(实验) 细胞毒实验(讲解). 实验目的. 掌握补体依赖细胞毒试验的原理及操作方法 熟悉各种细胞毒实验的原理和检测方法. 实 验 原 理. 细胞性抗原 与 特异性抗体 (IgG1,2,3 或 IgM) 的结合可激活 补体 活化的经典途径,引起细胞膜损伤,膜通透性改变而吸收染料,使细胞着色,胀大而死亡,失去正常的折光性。根据死细胞的多少判断细胞毒性的强弱。

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Presentation Transcript
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实验内容
  • 补体依赖的细胞毒试验(实验)
  • 细胞毒实验(讲解)
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实验目的
  • 掌握补体依赖细胞毒试验的原理及操作方法
  • 熟悉各种细胞毒实验的原理和检测方法
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实 验 原 理

细胞性抗原与特异性抗体(IgG1,2,3或IgM)的结合可激活补体活化的经典途径,引起细胞膜损伤,膜通透性改变而吸收染料,使细胞着色,胀大而死亡,失去正常的折光性。根据死细胞的多少判断细胞毒性的强弱。

本次实验采用抗Thy-1血清(Thy-1是T细胞的一种表面标志)与小鼠的胸腺和脾的T细胞相互作用,通过激活补体对胸腺和脾的T细胞进行杀伤。

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T细胞+抗Thy-1抗体

+

补体

实 验 原 理 示 意 图

MAC

T Cell

细胞溶解现象

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实验分组
  • 四人一组,1只小鼠/组。
  • 两人做脾,两人做胸腺。
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操作步骤
  • 将3mlPBS先放到平皿中。
  • 小鼠脱颈处死,取脾和胸腺(分别位于左侧腹部和胸骨柄处)
  • 取胸腺和脾脏分别放到平皿中,用直头镊子固定组织,用弯头镊子轻压组织,将其捣碎,再将3-4层纱布覆盖到组织上,然后用滴管隔着纱布将细胞悬液吸出。
  • 按下图加样:>>
  • 混匀后放置37℃水浴,孵育40分钟。
  • 取出后每管加入50ul台酚兰染液,混匀后立即取出染色的细胞悬液20ul滴到玻片上,用盖玻片盖上,在显微镜下观察。
  • 观察结果:计数200个细胞中死细胞数(死细胞形态为肿胀变大,失去折光性,呈兰色)。
  • 结果判定 :>>
slide11

阳性管活细胞数

)×100%

细胞毒百分率(%)=

(1-

阴性管活细胞数

结 果 判 定

Ag+C

Ag+Ab+C

阳性管

阴性管

阳性管

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注意事项
  • 靶细胞浓度要适中,过高或过低均会影响试验结果。
  • 台酚兰染色时间不要太长,因为台酚兰本身具有一定的毒性作用,可致细胞死亡。
  • 补体要新鲜采集,三只以上的豚鼠的血清混合。
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补体依赖性细胞毒实验的应用
  • 细胞性抗原的测定
  • 单克隆抗体的筛选和鉴定
  • 组织相容性抗原的检查与分型
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细胞毒试验的分类
  • 抗体依赖细胞介导的细胞毒试验(ADCC)
  • 补体依赖的细胞毒试验(CDC)
  • 细胞介导的细胞毒试验
  • NK细胞介导的细胞毒试验
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抗体依赖细胞介导的细胞毒试验(ADCC)

  • ADCC反应是由多种不同效应细胞群介导的杀伤性效应机制之一。
  • 选用适当的靶细胞,加相应的免疫血清,再加入效应细胞,作用一段时间后,观察靶细胞被破坏的程度并推测效应细胞的ADCC作用。
  • 淋巴细胞的若干亚群如NK细胞,以及巨噬细胞等都具有这种杀伤功能。
  • ADCC反应中所用的靶细胞也是多种多样的,常用的是同种或异种红细胞,或传代的肿瘤细胞系等。
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补体依赖的细胞毒试验(CDC)

实验原理:

细胞性抗原与特异性抗体(IgG1,2,3或IgM)结合后,可激活补体活化的经典途径,引起细胞膜受损,细胞膜通透性改变,而使细胞外低渗的液体(水)进入细胞,使细胞胀大死亡。

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细胞介导的细胞毒试验

  • 细胞介导的细胞毒试验是检测细胞毒性T细胞(CTL)对靶细胞的杀伤作用。
  • CTL对靶细胞具有直接杀伤作用,能特异杀伤某些肿瘤细胞或病毒感染的细胞。
  • CTL的细胞毒活性是评价机体细胞免疫功能的指标,但其检测需要抗原预先致敏。
  • 测定肿瘤患者CTL对瘤细胞的杀伤作用对判断肿瘤预后及观察疗效有重要意义。
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NK细胞介导的细胞毒试验
  • NK细胞:无需抗原预先致敏就能杀伤靶细胞的大颗粒淋巴细胞、对肿瘤细胞及某些病毒感染的细胞具有明显的杀伤作用。
  • NK细胞杀伤方式:

1.直接接触启动杀伤:NK 细胞一旦与靶细胞结合后,即可被活化发生细胞内颗粒重排,释放NK细胞毒因子、穿孔素等物质破坏靶细胞。

2. ADCC作用杀伤靶细胞。

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细胞毒试验检测方法
  • 形态学检测方法(ADCC、CDC、NK)
  • 同位素释放法(CTL、NK、ADCC)
  • 酶释放法(ADCC、NK)
  • 凋亡检测法(NK)
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同位素释放法
  • 原理:用放射性核素标记靶细胞,当靶细胞受到破坏时,放射性核素被释放出来,通过测定释放或残留在未破坏细胞内的放射性核素的放射活性,即可计算和推测杀伤细胞的细胞毒活性。
  • 常用的放射性核素:51Cr、3H-TdR、125I-UdR等。
  • 优缺点:优点是敏感、简便、流程短等;缺点是试验条件要求高,并且同位素具有化学毒性和放射毒性,对人体有害。
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51Cr

靶细胞

测量上清液中释放的51Cr

效应细胞

洗涤

去除游离的51Cr

混合培养4-6小时

细胞毒试验(51Cr释放法)示意图

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酶释放法----乳酸脱氢酶释放法

原理:乳酸脱氢酶(LDH)存在于细胞内,正常情况下不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时,细胞膜通透性改变,LDH可从细胞内释放到培养液中。利用效应细胞与靶细胞进行反应并离心取上清,借助比色法测定靶细胞膜受损后从胞内所释放出的乳酸脱氢酶活性,其水平反映效应细胞的杀伤活性。

优缺点:优点:经济、快捷、安全,可定量。

缺点:LDH分子较大,仅当靶细胞膜完全被破坏时才释放,故不能较早地反映效应的功能。

hbe assay
酶释放法---血红蛋白酶释放法(HbE-Assay)
  • 用于检测ADCC
  • 原理:红细胞被杀伤裂解后释放出的血红蛋白具有过氧化酶活性,在过氧化氢存在下,可催化底物邻-苯二胺等发生显色反应,用分光光度计测定显色程度来间接表示ADCC对靶红细胞的杀伤活性。
  • 优点:安全、简便。
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细胞凋亡检查法
  • 用于检测NK细胞的活性
  • 原理:效应细胞介导靶细胞凋亡时,内源性核酸水解酶将靶细胞DNA在核小体单位之间被切断,产生180-200bp(核小体单位长度)及其整数倍数的寡核苷酸片断,在琼脂糖电泳中呈现阶梯状DNA区带图谱,借以反映细胞凋亡。