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2008 级五年制本科生 免疫学实验课

2008 级五年制本科生 免疫学实验课. 补体依赖细胞毒试验. 实验内容. 补体依赖的细胞毒试验（实验） 细胞毒实验（讲解）. 实验目的. 掌握补体依赖细胞毒试验的原理及操作方法 熟悉各种细胞毒实验的原理和检测方法. 实 验 原 理. 细胞性抗原 与 特异性抗体 (IgG1,2,3 或 IgM) 的结合可激活 补体 活化的经典途径，引起细胞膜损伤，膜通透性改变而吸收染料，使细胞着色，胀大而死亡，失去正常的折光性。根据死细胞的多少判断细胞毒性的强弱。

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2008 级五年制本科生 免疫学实验课

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Presentation Transcript

  1. 2008级五年制本科生免疫学实验课

  2. 补体依赖细胞毒试验

  3. 实验内容 • 补体依赖的细胞毒试验（实验） • 细胞毒实验（讲解）

  4. 实验目的 • 掌握补体依赖细胞毒试验的原理及操作方法 • 熟悉各种细胞毒实验的原理和检测方法

  5. 实 验 原 理 细胞性抗原与特异性抗体(IgG1,2,3或IgM)的结合可激活补体活化的经典途径，引起细胞膜损伤，膜通透性改变而吸收染料，使细胞着色，胀大而死亡，失去正常的折光性。根据死细胞的多少判断细胞毒性的强弱。 本次实验采用抗Thy-1血清(Thy-1是T细胞的一种表面标志)与小鼠的胸腺和脾的T细胞相互作用，通过激活补体对胸腺和脾的T细胞进行杀伤。

  6. T细胞+抗Thy-1抗体 + 补体 实 验 原 理 示 意 图 MAC T Cell 细胞溶解现象

  7. 实验分组 • 四人一组，1只小鼠/组。 • 两人做脾，两人做胸腺。

  8. 物品分配

  9. 操作步骤 • 将3mlPBS先放到平皿中。 • 小鼠脱颈处死，取脾和胸腺(分别位于左侧腹部和胸骨柄处) • 取胸腺和脾脏分别放到平皿中，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎，再将3-4层纱布覆盖到组织上，然后用滴管隔着纱布将细胞悬液吸出。 • 按下图加样：>> • 混匀后放置37℃水浴，孵育40分钟。 • 取出后每管加入50ul台酚兰染液，混匀后立即取出染色的细胞悬液20ul滴到玻片上，用盖玻片盖上，在显微镜下观察。 • 观察结果：计数200个细胞中死细胞数(死细胞形态为肿胀变大，失去折光性，呈兰色)。 • 结果判定 ：>>

  10. 加 样 方 法

  11. 阳性管活细胞数 )×100% 细胞毒百分率(%)= (1- 阴性管活细胞数 结 果 判 定 Ag+C Ag+Ab+C 阳性管 阴性管 阳性管

  12. 注意事项 • 靶细胞浓度要适中，过高或过低均会影响试验结果。 • 台酚兰染色时间不要太长，因为台酚兰本身具有一定的毒性作用，可致细胞死亡。 • 补体要新鲜采集，三只以上的豚鼠的血清混合。

  13. 补体依赖性细胞毒实验的应用 • 细胞性抗原的测定 • 单克隆抗体的筛选和鉴定 • 组织相容性抗原的检查与分型

  14. 细 胞 毒 试 验

  15. 细胞毒试验的分类 • 抗体依赖细胞介导的细胞毒试验（ADCC） • 补体依赖的细胞毒试验（CDC） • 细胞介导的细胞毒试验 • NK细胞介导的细胞毒试验

  16. 抗体依赖细胞介导的细胞毒试验（ADCC） • ADCC反应是由多种不同效应细胞群介导的杀伤性效应机制之一。 • 选用适当的靶细胞，加相应的免疫血清，再加入效应细胞，作用一段时间后，观察靶细胞被破坏的程度并推测效应细胞的ADCC作用。 • 淋巴细胞的若干亚群如NK细胞，以及巨噬细胞等都具有这种杀伤功能。 • ADCC反应中所用的靶细胞也是多种多样的，常用的是同种或异种红细胞，或传代的肿瘤细胞系等。

  17. 补体依赖的细胞毒试验（CDC） 实验原理： 细胞性抗原与特异性抗体(IgG1,2,3或IgM)结合后，可激活补体活化的经典途径，引起细胞膜受损，细胞膜通透性改变，而使细胞外低渗的液体（水）进入细胞，使细胞胀大死亡。

  18. 细胞介导的细胞毒试验 • 细胞介导的细胞毒试验是检测细胞毒性T细胞(CTL)对靶细胞的杀伤作用。 • CTL对靶细胞具有直接杀伤作用，能特异杀伤某些肿瘤细胞或病毒感染的细胞。 • CTL的细胞毒活性是评价机体细胞免疫功能的指标，但其检测需要抗原预先致敏。 • 测定肿瘤患者CTL对瘤细胞的杀伤作用对判断肿瘤预后及观察疗效有重要意义。

  19. NK细胞介导的细胞毒试验 • NK细胞：无需抗原预先致敏就能杀伤靶细胞的大颗粒淋巴细胞、对肿瘤细胞及某些病毒感染的细胞具有明显的杀伤作用。 • NK细胞杀伤方式： １.直接接触启动杀伤：NK 细胞一旦与靶细胞结合后，即可被活化发生细胞内颗粒重排，释放NK细胞毒因子、穿孔素等物质破坏靶细胞。 ２. ADCC作用杀伤靶细胞。

  20. 细胞毒试验检测方法 • 形态学检测方法（ADCC、CDC、NK） • 同位素释放法（CTL、NK、ADCC） • 酶释放法（ADCC、NK） • 凋亡检测法（NK）

  21. 同位素释放法 • 原理：用放射性核素标记靶细胞，当靶细胞受到破坏时，放射性核素被释放出来，通过测定释放或残留在未破坏细胞内的放射性核素的放射活性，即可计算和推测杀伤细胞的细胞毒活性。 • 常用的放射性核素：51Cr、3H-TdR、125I-UdR等。 • 优缺点：优点是敏感、简便、流程短等；缺点是试验条件要求高，并且同位素具有化学毒性和放射毒性，对人体有害。

  22. 51Cr 靶细胞 测量上清液中释放的51Cr 效应细胞 洗涤 去除游离的51Cr 混合培养4-6小时 细胞毒试验(51Cr释放法)示意图

  23. 酶释放法----乳酸脱氢酶释放法 原理：乳酸脱氢酶（LDH）存在于细胞内，正常情况下不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，细胞膜通透性改变，LDH可从细胞内释放到培养液中。利用效应细胞与靶细胞进行反应并离心取上清，借助比色法测定靶细胞膜受损后从胞内所释放出的乳酸脱氢酶活性，其水平反映效应细胞的杀伤活性。 优缺点：优点：经济、快捷、安全，可定量。 缺点：LDH分子较大，仅当靶细胞膜完全被破坏时才释放,故不能较早地反映效应的功能。

  24. 酶释放法---血红蛋白酶释放法(HbE-Assay) • 用于检测ADCC • 原理：红细胞被杀伤裂解后释放出的血红蛋白具有过氧化酶活性，在过氧化氢存在下，可催化底物邻-苯二胺等发生显色反应，用分光光度计测定显色程度来间接表示ADCC对靶红细胞的杀伤活性。 • 优点：安全、简便。

  25. 细胞凋亡检查法 • 用于检测NK细胞的活性 • 原理：效应细胞介导靶细胞凋亡时，内源性核酸水解酶将靶细胞DNA在核小体单位之间被切断，产生180-200bp(核小体单位长度)及其整数倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖电泳中呈现阶梯状DNA区带图谱，借以反映细胞凋亡。

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