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Marcatori molecolari. Caratteristiche e applicazioni. Luca Gianfranceschi e Rosanna Marino. I marcatori molecolari Strumento per l’analisi genetica. Strumento  non oggetto di studio Molecolari  biologia molecolare Analisi genetica  studio delle differenze genetiche

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Presentation Transcript
marcatori molecolari

Marcatori molecolari

Caratteristiche e applicazioni

Luca Gianfranceschi e Rosanna Marino

i marcatori molecolari strumento per l analisi genetica
I marcatori molecolariStrumento per l’analisi genetica

Strumento non oggetto di studio

Molecolari  biologia molecolare

Analisi genetica studio delle differenze genetiche

Marcatori  approccio indiretto

alcune definizioni
Alcune definizioni

Marcatore genetico:Locus genico che identifica univocamente una regione cromosomica

Mappa genetica:Definisce le RELAZIONI LINEARI tra marcatori molecolari E’ IL RISULTATO DELL’ANALISI GENETICA

Distanza genetica: Stima della distanza esistente tra due marcatori calcolata sulla frequenza di ricombinazione- Si esprime in Centimorgan (cM)- 1cM = 1 ricombinante / 100 prodotti meiotici

Polimorfismo: Presenza di varianti alleliche per un dato gene o marcatore

Polimorfismo molecolare:Differenze evidenziabili a livello di DNA

i marcatori genetici
I marcatori genetici
  • Marcatori morfologici
    • Problemi: 1) non sono molto numerosi

2) dipendono dalla specie (ploidia ecc.)

  • Marcatori molecolari
    • Identificano polimorfismo a livello di DNA
    • Offrono la possibilità di coprire tutto il genoma
    • Sono applicabili universalmente
marcatore genetico ideale
Marcatore genetico ideale
  • Non influenzato dall’ambiente
  • Neutrale
  • Stabile
  • Facile da monitorare
  • Numeroso
  • Codominante
  • Polimorfico
  • Presente in qualsiasi tessuto
  • Indipendente da sesso ed età
  • Analisi automatizzabile

N.B. Peccato che non ci sia !!

tecniche per la produzione di marcatori molecolari
Tecniche per la produzione di marcatori molecolari
  • Ibridazione molecolare
    • Southern blot  es. RFLP
  • Amplificazione del DNA
    • PCR (Polymerase Chain Reaction) RAPD, SSR o STR
  • Approcci misti
    • Digestione enzimatica e amplificazione CAPS, AFLP
la reazione a catena della polimerasi polymerase chain reaction pcr
La reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction - PCR)
  • Inventata da Kary Mullis nel 1985
  • Gli è valsa il Nobel nel 1993

Fondamenti:

    • Conoscenze sulla replicazione del DNA

- DNA polimerasi

    • Sintesi in vitro di DNA a sequenza specifica

- Oligonucleotidi

    • Biologia dei batteri estremofili

- DNA polimerasi Taq ricavata da Thermus aquaticus

i marcatori rapd random amplified polymorfic dna
I marcatori RAPD(Random Amplified Polymorfic DNA)
  • Basati su PCR
  • Non sono necessari dati di sequenza
  • Automatizzabili
  • Oligonucleotidi (primer) sono corti e di sequenza casuale
  • Temperatura di annealing è bassa: 37°C
  • Richiedono poco DNA di partenza
  • La tecnica è facile

Problemi

  • Scarsa ripetibilità
  • Non sono locus-specifici
  • Non sono esportabili
  • Difficilmente confrontabili tra mappe e tra genotipi
  • Sono marcatori dominanti
analisi rapd di 9 variet di ciliegio
Analisi RAPD di 9 varietà di ciliegio

2000 bp

1500 bp

500 bp

1 2 3 4 5 6 7 8 9 M

I campioni 1 e 3 provengono dalla stessa varietà, così come i campioni 2 e 6; nella corsia 9 è stato usato DNA di amareno

i microsatelliti o ssr simple sequence repeat1
I microsatelliti o SSR(Simple Sequence Repeat)

Individuo 1

Individuo 2

1

2

3

4

5

6

Individuo 3

Individuo 4

Individuo 5

Individuo 6

analisi ssr di alcuni individui di una popolazione naturale
Analisi SSR di alcuni individui di una popolazione naturale

Individui della popolazione

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

-

1

2

3

4

5

+

6

Quanti alleli distinguete negli individui di questa popolazione?

gli snp single nucleotide polymorphism
Gli SNP(single nucleotide polymorphism)

...C C A T T G A C...

…G G T A A C T G...

...C C G T T G A C...

…G G C A A C T G...

  • Che cos’è uno SNP ?
  • E’ una differenza, o polimorfismo, di un singolo nucleotide nella sequenza di DNA esistente in alcuni individui della stessa specie.
  • Il loro numero varia notevolmente a seconda della specie
    • In uomo c’è in media uno SNP ogni 300 nucleotidi
perch utilizzare gli snps
Perché utilizzare gli SNPs
  • Sono la base molecolare della maggior parte delle differenze tra individui
  • Possono contribuire alla suscettibilità a malattie e all’adattabilità delle specie
  • Sono presenti in un elevato numero e sono distribuiti lungo tutto il genoma
impieghi dei marcatori molecolari
Impieghi dei marcatori molecolari
  • Analisi di paternità
  • Diagnosi di anomalie genetiche
  • Analisi forensi
  • Identificazione di QTL e geni utili
  • Miglioramento delle specie vegetali ed animali
  • Studio della struttura, evoluzione e biodiversità delle popolazioni
  • Studi di epidemiologia
  • Tracciabilità dei prodotti animali e/o dei GMO
  • Conservazione della natura
  • Studi di filogenesi ed evoluzione
programma di queste esercitazioni
Programma di queste esercitazioni
  • LUNEDÌ
    • Introduzione sui marcatori molecolari e loro usi
    • Estrazione del vostro DNA dalle cellule della mucosa boccale
  • MARTEDÌ
    • Spiegazione teorica sulla PCR e sull’uso che ne faremo
    • Amplificazione specifica di tre sequenze del vostro genoma
      • Marcatore altamente polimorfico D1S80 sul cromosoma 1
      • Marcatore Y-GATA-A7.2 sul cromosoma Y
      • Marcatore HUAMEL sul gene dell’amelogenina sulla regione omologa dei cromosomi X e Y
    • Preparazione dei gel di agarosio
  • MERCOLEDÌ
    • Elettroforesi dei prodotti di PCR sul gel di agarosio
    • Protocollo semplificato per l’estrazione di DNA da Kiwi
    • Analisi e discussione dei risultati ottenuti