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临床免疫学检验 (clinical immunological test)

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临床免疫学检验 (clinical immunological test)

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  1. 临床免疫学检验(clinical immunological test)

  2. 范畴(category): • 1、感染性疾病(infection disease) • 2、自身免疫性疾病(autoimmune ~) • 3、超敏反应性疾病(hypersensitivity ~ ) • 4、免疫缺陷/增殖性疾病 (immunoabnormal ~ deficiency/proliferation) • 5、肿瘤(tumour) • 6、移植(transplantation)

  3. 手段(measure)与目的(objective): • 应用免疫学的理论(theory)与技术 (technique),研究疾病的病因(致病) (pathogenesis)、发生(occur)、发展 (develop)和转归(turn),并对疾病进行 诊断(diagnosis)、疗效监测(curative effect monitor)和预防(prevent)。

  4. 内容(content): • 1、体液免疫检测(humoral~) • 2、细胞免疫检测(cellular ~) • 3、相关临床疾病的免疫检测 感染性疾病 自身免疫性疾病 超敏反应性疾病 免疫缺陷/增殖、肿瘤与移植

  5. 一、体液免疫检测(~test) • (一)血清免疫球蛋白检测 (human serum immunoglobulin ~) • (二)血清补体检测 (human serum complement ~) • (三)体液免疫相关其他检测 (others ~)

  6. (一)血清免疫球蛋白检测 • 免疫球蛋白(Immunoglobulins, Ig) 是具有抗体活性或化学结构与抗体相似 的球蛋白。 可分为分泌型和膜型两种,前者主要 存在于血清等体液中,如Ab;后者称膜 型免疫球蛋白(membrane Ig,mIg), 是B细胞膜上的抗原受体(receptor)。

  7. 抗体(antibodies, Ab)是B细胞识别 抗原后增殖分化为浆细胞所产生的,能 与相应抗原特异性(specific)结合 (recognize antigen and binding)并 发挥免疫功能(antigen and antibody reaction)的球蛋白。 • 所有抗体都是免疫球蛋白, 但免疫球蛋白不都是抗体。

  8. 临床检测的血清免疫球蛋白

  9. 健康人血清主要Ig含量(content)(g/L) 年 龄 IgG IgM IgA 新生儿6.6~17.5 0.01~0.06 0.06~0.21 6个月2.6~6.9 0.08~0.57 0.26~1.00 1 岁3.0~9.5 0.14~0.91 0.37~1.50 2 岁 4.7~12.3 0.21~1.45 0.41~1.75 8 岁6.3~15.0 0.46~2.51 0.47~2.20 12岁7.0~15.5 0.58~2.91 0.49~2.40 18岁 7.3~15.5 0.70~3.21 0.51~2.61 成人 7.0~16.0 0.70~3.00 0.40~2.80

  10. 检测手段(method): (In fluid phase) • (ring、immune-turbidity、et al) (Precipitation Reaction) (In agar) (diffusion) (electrophoresis)

  11. (In fluid phase )絮状沉淀试验: 环状沉淀试验 Ag Ab

  12. 透射免疫比浊: (turbidimetry) 在直射角度上测定光的透射强度,以吸收光单位(A)表示, A值与复合物量呈正比。

  13. (nephelometry) 在光路的5°-95°角的方向上测量散射光强度和被测溶液中微粒浓度关系的一种方法。 散射光:一定波长的光线沿水平轴通过复合物的混合液时导致光散射,散射光的强度与复合物量呈正比。 测定抗原抗体反应达平衡时~ ,终点(end) 测定单位时间内抗原抗体形成最大量时~,速 率(rate) • 散射免疫比浊(终点散射/速率散射):

  14. 临床意义(significance): • 1.血清多克隆Ig水平增高 患者血清中各型Ig均升高,常见于各种 感染特别是慢性(chronic)细菌感染,如肺结 核、慢性支气管炎、慢性肝病自身免疫性 (autoimmune)疾病。SLE患者以IgG、IgA升高 较多见,类风湿性关节炎——IgM增高为主。

  15. 多克隆抗体(polyclonal antibody): 由不同的B细胞克隆产生的抗体. • 单克隆抗体(monoclonal antibody): 由一个细胞克隆所产生的只识别单一 抗原决定簇的纯的抗体.

  16. 2.血清单克隆Ig水平增高 患者血清中出现异常增多的单克隆蛋白 (monoclonal protein,MP(即M蛋白))达 30g/L以上,而正常Ig包括与MP同类Ig的含量 则显著降低。此类异常增多Ig多无免疫活性, 主要见于免疫增殖性(immunoproliferative) 疾病,如多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM),原发性巨球蛋白血症(primary macro- globulinemia)、重链(heavy chain)病、轻 链(light chain)病等。

  17. 新生儿、婴幼儿由于体液免疫功能尚不成 熟,免疫球蛋白的含量较成人低,需按年 龄组进行分析与判断。 • 关于血清IgE和IgD的测定: 血清总IgE为0.13~0.92mg/L; 血清总IgD为0.6~2.0mg/L; IgE值升高多见于超敏反应性疾病,骨髓瘤 IgD值升高多见于骨髓瘤等。

  18. 异常免疫球蛋白检测: • M蛋白/(Monoclonal immunoglobulins ) 由一种单克隆B淋巴细胞异常增殖时产生的 具有相同结构和电场移动率的Ig分子或分子片段,一般不具有抗体活性,又称副蛋白(paraprotein)。 • 冷球蛋白(cryoglobulin) 指血清中一种蛋白,4℃不溶解,30℃易于 凝聚,37℃便溶解。存在于多种疾病,参 与炎症或免疫复合物引起的疾病。

  19. M蛋白的检测(免疫固定电泳)(immunofixation electrophoresis) 结果(result): 操作:待检血清 + 抗血清IgG IgA IgM Κ链 λ链 I 抗原抗体对应沉淀 并被固定,染色等

  20. 与M蛋白检测相关(related)疾病: • 1、多发性骨髓瘤(multiple myeloma) • 2、巨球蛋白血症(macroglobulinemia) • 3、重链病(heavy chain disease) • 4、轻链病(light chain disease) • 5、半分子病(half-molecule immunoglobulin disease) • 6、恶性淋巴瘤(malignant ~) • 7、良性M蛋白血症(benign ~)

  21. 例: • 多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM) 是浆细胞异常增殖的恶性肿瘤,也称浆细胞瘤(plasmocytoma)。是IPD中最常见的一种类型。1873年由Butzky首先并命名。

  22. MM的主要临床特征: ①进行性的骨质破坏,如骨质疏松和溶骨性病变, 常有骨痛、易骨折,为MM最典型特征; ②大量的M蛋白导致血液粘度增高,呈高粘血症或沉积 于肾小管中,肾小管上皮细胞淀粉样变性,发生肾病 综合征。损害中枢神经系统,可出现神经功能障碍; ③骨髓损伤可引起贫血、粒细胞和血小板减少; ④浆细胞浸润其他组织,如脊髓和神经根受压时引起 运动功能障碍等; ⑤男性多发,平均发病年龄46岁左右; ⑥恶性程度高,预后不良; ⑦易感染。

  23. MM的主要免疫学特征: ①血清中出现大量的M蛋白:IgG>35g/L, IgA>20g/L, IgM>15g/L, IgD>2.0g/L,IgE >2.0g/L;或尿中有本周蛋白(>1.0g/24h 尿); ②血清中正常Ig 水平明显降低; ③骨髓中有无限扩增的异常浆细胞 (≥15%)为主要病理特征,组织证实有浆 细胞瘤; ④有溶骨性损害。

  24. 不同类型的多发性骨髓瘤: 类 型 发生率(%) 本周蛋白尿阳性(%) 临 床 特 点 IgG 50~60 50~70 典型症状 IgA 20~25 50~70 高粘综合征较多见 IgD 1~2 90 骨髓外病变、溶骨病 变多见,44%淀粉样变 IgE 0.01 少见 IgM <1 90 高粘综合征最常见 非分泌型 1~5 无 溶骨病变较少,神 经系统损害较多见

  25. MM的发病机制 发病机制不明,与下列因素有关。 (1)是遗传与环境因素综合作用的结果。主要发生 在1号、11号、14号染色体,使浆细胞可发生永生化 (2)造血干细胞的异常 。形成浆细胞瘤。 (3)细胞因子的异常 。MM患者可有IL-6异常增高, 体外内实验证明IL-6可促使MM细胞增殖、生长和存 活,使MM细胞增多。IL-6增高直接效应是抑制IL-4的 产生,从而抑制了正常的体液免疫功能。 (4)与粘附分子、IL-6等信号传递受体和B细胞1~2 等抑制凋亡的受体高表达有关。

  26. 本周蛋白(bence-jones protein): 1847年由Bence-Jones在病人的尿液中检出而命名。已知M蛋白不具有免疫活性,无正常免疫球蛋白的功能,其轻链分子小可通过肾小球滤过从尿排除。 (本周蛋白是从尿中检出的M蛋白轻链)

  27. 冷球蛋白的检测(定性):

  28. 冷球蛋白的定量分析 鉴定沉淀中蛋白质类型,可将沉淀用冷缓冲 液洗涤后,再溶于巴比妥缓冲液中,固定电 泳或免疫电泳鉴定。 • 冷球蛋白检测的注意事项 采血过程要保温,用品用预温,4℃下放置时 间要一周,正常人血清也可含有冷球蛋白, 多数在80μg/L 以下。

  29. (二)血清补体检测 • 补体(complement)是指血清中具有酶活性的一组不耐热球蛋白。 A. C1~C9(C1q、r、s); B. B因子、D因子、P因子、H因子; C. C1抑制物、C4结合蛋白、促衰变因子 等。

  30. 溶血程度与补体含量的关系:

  31. 补体相关的实验室检测: • 1、总补体溶血活性测定(CH50) 反映主要补体C1~C9成分的综合水平。 试管法:正常参考值范围 50 ~100U/ml 脂质体免疫法:其范围23 ~46U/ml 测得值高:急性炎症、损伤、恶性肿瘤 测得值低:补体消耗相关疾病 补体合成降低(肝病) 先天性缺陷

  32. 2、补体单个成分检测(C3、C4、C1q) 方法:免疫比浊法、单向免疫扩散法

  33. 补体单个成分检测的意义: • 若血清C3含量增高,由于C3是急性时相反应蛋 白,在急性炎症、传染病早期、急性组织损伤、恶 性肿瘤、移植物排斥反应时增高。但是补体含量增 高的临床意义不大。 • 若血清C3含量降低,见于合成能力低下,如慢性 肝病;合成原料不足,如营养不良;补体消耗或丢 失增多,如系统性红斑狼疮活动期、白血病化疗 后、大量失血、大面积烧伤。 • 血清C4含量降低,见于多发性骨髓瘤、遗传性血 管性水肿、遗传性C4缺乏症等。

  34. 二、细胞免疫(cellular~)检测 • 参与机体细胞免疫反应的细胞 T淋巴细胞 B淋巴细胞 NK细胞(自然杀伤) 中性粒细胞 针对细胞的数量(amount)、活性(功 能 function)、表面标志物(membrane molecules)表达(express)程度~。

  35. T细胞表面标志物(主要): 1、羊RBC受体(E花环) 2、T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR) 3、CD3,CD4/CD8;CD28,152,154和CD2等 (Cluster of differentiation;CD) 4、丝裂原受体(PHA/ConA~) 5、MHC分子(MHV-Ⅰ类分子) 6、细胞因子受体~

  36. 临床常见的细胞免疫检测项目 • T细胞表面标志物检测 (membrane molecules of T lymphocytes~) 通过检测T淋巴细胞表面特有的标志物 识别,计数细胞总数;分析细胞亚群。 方法:E玫瑰花环形成试验 (Erythrocyte rosette forming cell test) T细胞分化抗原(CD)测定 (Cluster Differentiation of T cells~ )

  37. E玫瑰花环形成试验: • T细胞表面有特异性绵羊红细胞 (SRBC) 受体,即E受体。将T细胞与SRBC按一定比例混匀,置4℃至少2h或过夜,T细胞表面的E受体能与SRBC结合形成以T细胞为中心,四周环绕SRBC的花环样结构(见图)镜检计数可得总花环(Et)形成率,亦即T细胞的百分率。

  38. 正常参考值范围 Et 64.4±6.7% Ea 20%~40%

  39. 流式细胞术(flowcytometry,FCM):CD3+T细胞61~85%;CD4+T细胞 28~58%;CD8+T细胞 19~48%;CD4+/CD8+T细胞比值1.66±0.33(>1)。

  40. T淋巴细胞功能检测(function~) • T淋巴细胞体外培养,在有丝分裂原作用下 细胞内核酸与蛋白质合成增加,细胞发生母细 胞化(transformation )~,或经混合(mixed) 淋巴细胞培养等来帮助细胞免疫功能评估。 方法:形态学(morphologic counting ) 3H-胸腺嘧啶核苷掺入法 (3H-thymidine incorporation) MTT法(MTT colorimetry) Mixed lymphocyte culture (one-way/two-way)

  41. Lymphocyte transformation (%) =(transferred lymphocyte)÷200×100% Reference value: ~70%

  42. (3H-thymidine incorporation): T细胞经有丝分裂原刺激,向母细胞转 化时胞内DNA合成活跃, 3H-胸腺嘧啶核 苷作为原料摄入,3H-胸腺嘧啶核苷的 掺入量与细胞增殖相关(SI>2,正常) Stimulating index (SI) = mean CPM of the stimulated cells/ mean CPM of the corresponding control Cells (unstimulated=control )

  43. MTT法(colorimetry): 细胞增殖代谢活跃,细胞内线粒体脱 氢酶活性增高,通过线粒体能量代谢 使得MTT代谢形成紫色甲潜,经细胞溶 解分析吸光度,估计细胞增殖程度(SI>2)。 methyl thiazolyte trazolium;MTT 四甲基偶氮唑盐,为一种染料.

  44. 混合淋巴细胞培养(mixed culture): 将两个无关的淋巴细胞混合培养, 由于不同个体MHC的差异,彼此都以对方 为抗原发生反应,导致T细胞转化。 T细胞转化能力可通过3H-胸腺嘧啶 核苷掺入法、MTT法,检测分析。

  45. B淋巴细胞表面标志物检测 • B淋巴细胞表面标志物: 1、膜表面免疫球蛋白(SmIg) 2、分化抗原(CD19~22和CD29) 3、Fc受体(Fc receptor) 4、补体受体(complement receptor) 5、EB病毒受体等(EB virus receptor)

  46. 检测方法(method): 1、免疫荧光(fluorescence immunoassay) 法测SmIg(用5种抗Ig抗体+B细胞——荧光显 微镜下计数). 参考值: SmIg+细胞总数16~28%,其中G+ 4~ 13%;M+7~13%;A+1~4%;D+5~8%; E+0~ 1.5%。 2、流式细胞术(flowcytometry,FCM)检测B 细胞分化抗原(CD19). 参考值: CD19+细胞 11.74%±3.73%

  47. B淋巴细胞功能检测(function): 1、B淋巴细胞增殖(proliferation)试验 2、溶血空斑(hemolytic plaque)试验 3、酶联免疫斑点法(ELISPOT) 4、体内试验(皮试)(Ⅰ/Ⅳ)

  48. ELISPOT: • 用抗原包被固相,加入待检的抗体产生细胞,再诱导其抗体的分泌。 • 分泌的抗体与包被于固相的抗原结合,在抗体形成细胞周围形成抗原抗体复合物。 • 再加入酶标记二抗,通过底物的显色反应镜下计数着色斑点,并记录显色的深浅、范围,可评估B细胞功能~

  49. 斑点计数,数据分析 阳性 阴性