Introducción a la Microscopía de Fluorescencia

1. Introducción a la Microscopía de Fluorescencia Renzo Gavilanez Motic Instruments, Inc

2. Microscopía de FluorescenciaContenido: • Principio • Aplicaciones • Para Ciencias de la Vida • Para Ciencias de Materiales • Equipo necesario • Microscopio • Fuentes de Luz • Juego de Filtros • Selección de filtros • Lentes Objetivos

3. Fluorescencia Espectro de luz visible: La longitud de onda determina el color

4. Fluorescencia ¿Qué es? Es un proceso de interacción entre la radiación y la materia en el cual un material absorbe radiación de una fuente específica y muy rápidamente emite luz cuya energía es menor (de mayor longitud de onda) que la de la radiación que ha absorbido.

5. Fluorescencia Espectro de luz visible: Excitación Emisión

6. Fluorescencia ¿Cómo se produce? Los electrones son excitados a estados vibracionales y rotacionales más altos y cuando vuelven a su estado fundamental emiten la energía de excitación en forma de radiación.

7. Fluorescencia (definiciones) ● Debido a la disipación interna de energía la luz emitida tiene siempre una longitud de onda mayor (menor energía) que la luz de excitación. ● La cantidad de luz emitida es muy pequeña en comparación con la utilizada para la excitación. ● Los materiales que fluorescen lo hacen porque contienen estructuras con configuraciones moleculares particulares conocidas como fluoróforos o fluorocromos.

8. Fluorescencia (definiciones) ● Un fluorocromo es una molécula capaz de absorber fotones y emitir fotones de menor energía (mayor longitud de onda). ● Un fluoróforo es la parte del fluorocromo responsable de la emisión de la fluorescencia.

9. Fluorescencia (definiciones) Tipos de fluorescencia: ● La fluorescencia primaria es la que se da porque existe una configuración inherente a la estructura molecular. Algunas de las fluorescencias más intensas que se observan se asocian con moléculas aromáticas, la fluorescencia de materiales inorgánicos se observa en muchos minerales y piedras preciosas, y quelatos específicos: Clorofila, aceite de inmersión, GFP

10. Fluorescencia (definiciones) Tipos de fluorescencia: ● La fluorescencia secundaria ocurre cuando una molécula específica o un grupo capaz de fluorescer, un fluorocromo, se introduce en la estructura de la muestra. Éste es el procedimiento para la mayoría de las aplicaciones biológicas de la microscopía de fluorescencia.

11. Fluorescencia Espectros de excitación y emisión: Debido a la diferente configuración electrónica de los fluorocromos cada uno presenta un espectro de excitación y de emisión característico y único. Los fabricantes dan el pico de máxima excitación y el pico de máxima emisión o bien los espectros de excitación y emisión.

12. Fluorescencia Espectros de excitación y emisión: Fluoresceína (FITC) pH = 9 pH = 13

13. Fluorescencia ¿Porqué usar Fluorescencia? • Para facilitar pequeñas estructuras debido al alto contraste de la imagen sobre el fondo (buena relación señal a ruido) • Fondo Negro (pupilas se abren apliamente)

14. Microscopía de Fluorescencia - Aplicaciones Ciencias de la Vida • Inmunohistoquímica/Histología Para identificar la distribución de una proteína específica dentro de un tejido, un fluorocromo puede ser usado para marcar la proteína vía un anticuerpo 2. Biología • Para monitorear rápidamente concentraciones fisiológicas cambiantes de iones, e.g. calcio, magnesio y valores pH en células vivas. • Para estudiar viabilidad de tejidos animales/humanos y patógenos.

15. EGFP expression in muscles of C. elegans Filtersystem: EGFP longpass Microscopía de Fluorescencia - Aplicaciones GFPs como proteína que se expresa en cuerpos vivos (GFP: Proteína fluorescente verde, de medusa Aequorea)

16. Microscopía de Fluorescencia - Aplicaciones Dapi FITC Cy 3 Cy 3.5 Cy 5 Cy 7 Cromosomas con 6 fluorocromos

17. FISH(Fluorescence in situ Hybridisation) Microscopía de Fluorescencia - Aplicaciones

18. Microscopía de Fluorescencia - Aplicaciones II. Ciencia de Materiales • Inspección de Circuitos electrónicos • Investigación de contaminantes en wafers semiconductores • Estudios de sedimentación petrológica en rocas

19. Microscopía de Fluorescencia - Aplicaciones Huecos en concreto

20. Equipo Necesario • Que equipo se requiere? • Microscopio con accesorio de fluorescencia • Fuente de luz: HBO 50/100 Watt o LED • Set de Filtros (3 filtros en 1 cubo) • Objetivos con alta apertura numérica (A.N.)

21. Equipo Necesario

22. Equipo Necesario • Fuente de poder • Accesorio de fluorescencia • Caja de lámpara • Cubos con filtros

23. Equipo Necesario

24. Equipo Necesario

25. Equipo NecesarioLa lámpara de mercurio • Lámpara de mercurio HBO100Watt • Arco de dimensión pequeña • Gran cantidad de energía • Relación Excitación/Emisión 10000:1 Conclusión: Utiliza cada fotón disponible

26. Equipo NecesarioLas lámparas LED o de Aluro Metálico • Lámpara LED específica para cada longitud de onda, larga vida, no requiere reemplazo de lámpara, no caliente, no se requiere centrado, permite controlar intensidad • Lámpara Aluro Metálico genérica para todas las longitudes de onda, larga vida, no requiere reemplazo de lámpara, no caliente, no se requiere centrado, permite controlar intensidad

27. Equipo NecesarioEl cubo con filtros • Filtro de Excitación • Espejo dicróico • Filtro de Barrera o Emisión (longpass, bandpass)

28. Filtros Estándard de Fluorescencia

29. Especificacón del Filtro - FITC Perfiles de Absorción y Emisión

30. Selectividad de Filtros DAPI

31. Selectividad de Filtros FITC

32. Selectividad de Filtros TRITC

33. Selectividad de Filtros Sobreposición de imágenes

34. Selectividad de Filtros DAPI

35. Selectividad de Filtros FITC

36. Selectividad de Filtros TRITC

37. Selectividad de Filtros Sobre-posicio-namiento Multi-Focus!

38. CFP / YFP / DsRed Hela cell, tripleband CFP / YFP / DsRed Hela cell, singleband overlay (mFIP, SIS) Sistemas de Filtros de banda Dual/Triple + Visión completa + no requiere cambio de filtro (tiempo real) + desplazamiento de píxel cero ± colores mezclados - Pérdida de intensidad comparada con filtros de una sola banda

39. Plan 20x/0.40 Plan Apo 20x/0.60 Plan Fluar 20x/0.50 Equipo NecesarioLentes Objetivos • No existe conexión directa entre lentes de fluorita y fluorescencia • Fluorita viene de CaF2, un mineral usado antiguamente para fabricar objetivos de gran apertura numérica • La Apertura Numérica es más importante que la corrección de curvatura • Se pueden usar objetivos de contraste de fases pero no es recomendable porque reducen entre un 15 - 20% de intensidad

40. FIN Gracias por prestar atención!!!