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MÉTODOS DE REVELAÇÃO EM GÉIS E DETECÇÃO DE IMAGENS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA

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MÉTODOS DE REVELAÇÃO EM GÉIS E DETECÇÃO DE IMAGENS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA - PowerPoint PPT Presentation


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Universidade Federal do Ceará Rede Nordeste de Biotecnologia Analise Proteômica. MÉTODOS DE REVELAÇÃO EM GÉIS E DETECÇÃO DE IMAGENS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA. Erika B. de Menezes Prof. Arlindo de Alencar A. Moura. MÉTODOS DE REVELAÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA.

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m todos de revela o em g is e detec o de imagens na abordagem prote mica

Universidade Federal do Ceará

Rede Nordeste de Biotecnologia

Analise Proteômica

MÉTODOS DE REVELAÇÃO EM GÉIS E DETECÇÃO DE IMAGENS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA

Erika B. de Menezes

Prof. Arlindo de Alencar A. Moura

m todos de revel o em g is na abordagem prote mica
MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA
  • Propriedades desejáveis
    • Faixa dinâmica de detecção;
    • Sensibilidade;
    • Linearidade;
    • Reprodutibilidade;
    • Compatível com espectro de massa;
    • Baixa toxicidade;
    • Baixo custo.

(Lópes, 2007)

m todos de revel o em g is na abordagem prote mica4
MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA
  • 1 µg de Proteína

Revelação por Coomassie

Revelação pela Prata

(Lópes, 2007)

m todos de revel o em g is na abordagem prote mica5
MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA
  • Revelação por Azul Brilhante de Coomassie - CoomassieBlue
  • Revelação fluorescente (Sondas Moleculares)
    • SyproRuby
    • Eletroforese em gel diferencial – DIGE
  • Revelação pela Prata
revela o por azul brilhante de coomassie
REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE
  • Azul Brilhante de Coomassie
    • Composto aromático de caráter ácido
        • Tingir lã
          • “Tintura de Coomassie”
  • 1963
    • Revelação de proteínas

(Fazekas de St. Groth et al., 1963)

revela o por azul brilhante de coomassie8
REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE
  • CBB-R 250
    • Aromático sulfatado, não polar
      • Ácido acético e metanol
        • Interações iônicas
        • Interações secundárias
          • Pontes de hidrogênio
          • Interação de Van der Waals
          • Interações hidrofóbicas (amônia sulfatada)

(Fazekas de St. Groth et al., 1963)

revela o por azul brilhante de coomassie9
REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE
  • Ácido tricloroacético (TCA a 12,5%)
      • Alta acidez e propriedade corrosiva
  • Coomassie Blue (CBB-R 250)
    •  sensibilidade

(Fazekas de St. Groth et al., 1963)

(Merril, 1990)

revela o por azul brilhante de coomassie10
REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE
  • CBB-G 250 (Coomassie Blue colloidal)
    • Dimetilado  CCB-R
      • 20% de metanol
      •  [sulfato de amônio]
      • Pnt/CCB-G
        • Não penetra na matriz apenas interage com a pnts.

(Neuhoff et al., 1988)

(Fazekas de St. Groth et al., 1963)

revela o por azul brilhante de coomassie11
REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE
  •  sensibilidade
    • 10 ng ptn/banda
  • Formação do colóide
    • Prolongou o tempo de coloração
  • Metanol  etanol
    • Tempo recomendado foi de pelo menos 24h

(Brush, 1998)

(Neuhoff et al. 1985)

revela o por azul brilhante de coomassie12
REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE
  • Sulfato de alumínio (Al2(SO4)3)
      •  a ligação do corante as proteínas
      •  Sensibilidade

(Kang et al. 2002)

A – Coomassie Blue

B- Coomassie Coloidal

*Sulfato de amônio + etanol

C- Prata

(Kang et al. 2002)

revela o por azul brilhante de coomassie13
REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE
  • Coloração Azul
    • Sulfona do Coomassie
    • Amina das proteínas
  • Especificidade
    • Proteínas
      • Não requer separação prévia das Pnt e Aa.

(Reisner et al., 1975)

(Fazekas de St. Groth et al., 1963)

(Chrambach et al., 1963)

revela o por azul brilhante de coomassie14
REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE
  • Vantagens
    • Intensa capacidade de coloração;
    • Elevada solubilidade em géis de poliacrilamida e agarose;
    • Capacidade de distinção entre pnt e Aa.;
    • Compatível com Espectro de Massa;
    • Estável na forma sólida;
    • Fácil manuseio;
    • Baixo custo.

(Fazekas de St. Groth et al., 1963)

revela o por azul brilhante de coomassie15
REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE
  • Limitações
    • Fraca revelação das bandas;
    • Pouco contraste com o gel levemente corado de azul;
    •  Sensibilidade;
      • 50 a 100 x menos sensível que a prata;
    •  Faixa dinâmica de detecção.
revela o fluorescentes
REVELAÇÃO FLUORESCENTES
  • Revelações Sypro – Sondas moleculres
    • Sypro Orange;
    • Sypro Red;
    • Sypro Tangerine;
    • Sypro Ruby.

1D SDS PAGE

2D SDS PAGE

(Pathon et al., 2002)

revela o fluorescentes20
REVELAÇÃO FLUORESCENTES
  • Sypro Ruby
    • Coloração baseado em um quelato;

Cultura de Fibroblastos

(Berggren et al., 2000)

(Pathon et al., 2002)

revela o fluorescentes21
REVELAÇÃO FLUORESCENTES
  • Sypro Ruby
    • Protocolo simples;
    • Glicoproteínas, lipoproteínas;
    • Compatível com EM;
    • Marcador durante a FIE
    • ½ vida longa – não foi alcançado aos 19’
    • Mais resistente a foto clareador

(Steinberg et al., 1996)

(Berggren et al., 2000)

(Steinberg et al., 2000)

(Berggren et al., 1999)

(Smejkal et al., 2004)

revela o fluorescentes22
REVELAÇÃO FLUORESCENTES
  • Sypro Ruby
    • Transiluminador UV
      • 300 nm
    • Scanner a laser
      • Typhoon
revela o revela o por corante fluorescentes
REVELAÇÃO REVELAÇÃO POR CORANTE FLUORESCENTES
  • Vantagens
    • Compatível com Espectro de massa (MALDI-TOF MS);
    • Identifica pequenas quantidade de ptn. ;
    •  Limite dinâmico linear
    •  variabilidade entre géis;
    • quando comparada com a prata
      • Permite visualizar + 20% de spots
    • Melhor reprodutibilidade;
    • Reutilização para vários géis.

(Lopez, 2000)

(Patton, 2000)

(Patton, 2002)

revela o revela o por corante fluorescentes24
REVELAÇÃO REVELAÇÃO POR CORANTE FLUORESCENTES
  • Limitações
    • Elevado custo;
    • Uso de equipamento sofisticado
      • Scanner (Typhoon)
revela o fluorescentes25
REVELAÇÃO FLUORESCENTES
  • Eletroforese em gel diferencial – DIGE
    • Disponível em 1997

(Unlu et al., 1997)

slide27

REVELAÇÃO FLUORESCENTE

Cy3

controle

Cy5

Tratamento

27

(Unlu et al., (1997) (Issaq & Veenstra (2008)

revela o fluorescente28
REVELAÇÃO FLUORESCENTE
  • Vantagem
    • Menor tempo de analise;
    • Elimina o problema de reprodutibilidade;
    • Melhor comparação do perfil protéico entre indivíduos;
    • Maior acurácia nas comparações de proteínas de diferentes amostras (95% de confiança)
    • Alta sensibilidade.
revela o fluorescente29
REVELAÇÃO FLUORESCENTE
  • Limitações
    • Dificuldade de cortar spots para analise posterior;
    • Spots são visíveis por scanner específicos;
    • Elevado custo.
revela o pela prata31
REVELAÇÃO PELA PRATA
  • Laboratórios de histologia
  • Géis de Poliacrilamida – Switzer et al., 1976
    • Proteínas
  • Protocolos utilizados em 2D
    • Nitrato de Prata
    • Diamino de prata ou prata amoniacal [Ag(NH3)2]

(Merryl et al., 1976)

(Haines et al., 1990)

revela o pela prata32
REVELAÇÃO PELA PRATA
  • Depende da redução do íon prata  prata metálica (Ag0)
    • (Ag  + elevado potencial de oxidação)
    • Íons Ag interagem com grupos
      • ácidos carboxílicos ( Asp e Glu), sulfidrilicos (Cys), e aminas (Lys).
    • Formando a prata metálica
  • 2 Ag(NH3)2++ 2 HS-R  2 Ag0 + 4 NH3 + R-S-S-R + 2 H+

(Haines et al., 1990)

revela o pela prata33
REVELAÇÃO PELA PRATA
  • Etapas
    • 1º fixação – insolubilização das proteínas no gel e remover componentes de interferência (Glicina, TRIS, SDS);
    • 2º Sensibilização
    • 3º Impregnação pela prata;
    • 4º Revelação
      • Nitrato de Prata – Formaldeído, Carbonato e tiosulfato

(Haines et al., 1990)

revela o pela prata34
REVELAÇÃO PELA PRATA
  • Etapas
    • 4º Revelação
      • Prata amoniacal – Formaldeído (agente redutor) e ácido cítrico ( íons Ag livre)
    • 5º Lavagens
  • Processo semelhante a revelação fotográfica.
revela o pela prata35
REVELAÇÃO PELA PRATA
  • Prata amoniacal
    • + contraste
    • + sensibilidade
    • + demorada
  • Bandas ou spots
    • Marrom ou preta
  • Lipoproteínas
    • Azul
  • Glicoproteínas
    • Vermelho
revela o pela prata36
REVELAÇÃO PELA PRATA
  • Vantagens
    • Sensibilidade
      • 100 x maior que o Coomassie
  • Abordagem proteômica
    • Pureza de uma ptn.
    • Detectar pequena quantidade de ptn.

(Switzer et al., 1979)

(Haines et al., 1990)

revela o pela prata37
REVELAÇÃO PELA PRATA
  • Limitações
    • Necessita de muitas etapas
      •  Reprodutibilidade (~20% na intensidade de spots)
    • Alguns íons de prata pode interferir na identificação da ptn;
    • Não apresentar ponto de saturação.

(Quadroni e James, 1999)

(Oses-Prieto et al., 2007)

m todos de detec o de imagens na abordagem prote mica
MÉTODOS DE DETECÇÃO DE IMAGENS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA
  • Detecção das imagens
    • Impossibilidade de se determinar visualmente a intensidade de spots ou bandas individualmente;
    • Interpretação de vários spots na 2D ser muito laboriosa  computador;
    • O grande volume de dados em laboratórios de pesquisa  Avaliar, processar e salvar são requeridos;
m todos de revel o em g is na abordagem prote mica41
MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA
  • Detecção das imagens
    • Impossibilidade de se determinar visualmente a intensidade de spots ou bandas individualmente;
    • Interpretação de vários spots na 2D ser muito laboriosa  computador;
    • O grande volume de dados em laboratórios de pesquisa  Avaliar, processar e salvar são requeridos. ;
m todos de revel o em g is na abordagem prote mica42
MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA
  • Detecção das imagens
    • Impossibilidade de se determinar visualmente a intensidade de spots ou bandas individualmente;
    • Interpretação de vários spots na 2D ser muito laboriosa  computador;
    • O grande volume de dados em laboratórios de pesquisa  Avaliar, processar e salvar são requeridos;
    • Criação banco de dados.
m todos de revel o em g is na abordagem prote mica43
MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA
  • Detecção das imagens
    • Impossibilidade de se determinar visualmente a intensidade de spots ou bandas individualmente;
    • Interpretação de vários spots na 2D ser muito laboriosa  computador;
    • O grande volume de dados em laboratórios de pesquisa  Avaliar, processar e salvar são requeridos;
    • Criação banco de dados.
m todos de revel o em g is na abordagem prote mica44
MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA
  • Eletroferograma
    • Câmeras acoplada a um computador;
    • Densicitometro;
    • Scanners.
m todos de revel o em g is na abordagem prote mica45
MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA
  • Scanner de Mesa
    • Alta performance;
    • Fácil uso – rápido;
    • Boa resolução;
    • Baixo custo.
m todos de revel o em g is na abordagem prote mica46
MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA
  • Imagem Scanner III
    • Alta resolução;
    • Densidade Ótica ( 3.4);
    • Resolução 100 e 600 dpi
      • Géis - 150 e 300 dpi
    • Revelações
      • Coomassie Blue
      • Prata
m todos de revel o em g is na abordagem prote mica48
MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA
  • Scanner de tela de fósforo de armazenamento
    • Técnica de autoradiografia
      • > sensibilidade;
      • Rapidez;
      •  limite linear dinâmico;
      • Laser de HeNe
        • 633 nm
m todos de revel o em g is na abordagem prote mica50
MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA
  • Scanner de Múltiplo propósito
    • Detecção fluorescente;
    • Tela de fósforo de armazenamento;
    • Quimiluminescência;
    • ≠ comprimentos de ondas associados a ≠ filtros;
    • Detectores são mais sensíveis
m todos de revel o em g is na abordagem prote mica51
MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA
  • Scanner de Múltiplo propósito
    • Laser com ≠ comprimentos de ondas
    • ≠ filtros

Westermeier, 2005

m todos de revel o em g is na abordagem prote mica52
MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA
  • Scanner de Múltiplo propósito
    • Typhoon 9410
m todos de revel o em g is na abordagem prote mica53
MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA
  • Scanner de Múltiplo propósito
    • ImageQuant LAS 4000