in v tro ara tirma y ntemler n.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
IN VİTRO ARAŞTIRMA YÖNTEMLERİ PowerPoint Presentation
Download Presentation
IN VİTRO ARAŞTIRMA YÖNTEMLERİ

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 61

IN VİTRO ARAŞTIRMA YÖNTEMLERİ - PowerPoint PPT Presentation


  • 352 Views
  • Uploaded on

IN VİTRO ARAŞTIRMA YÖNTEMLERİ. Prof. Dr. Hasan Bayram Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Göğüs Hastalıkları AD E-posta: bayram@gantep.edu.tr. Toraks 11.Yıllık Kongresi, Antalya Nisan 2008. Amaç.

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'IN VİTRO ARAŞTIRMA YÖNTEMLERİ' - blue


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
in v tro ara tirma y ntemler

IN VİTRO ARAŞTIRMA YÖNTEMLERİ

Prof. Dr. Hasan Bayram

Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi

Göğüs Hastalıkları AD

E-posta: bayram@gantep.edu.tr

Toraks 11.Yıllık Kongresi, Antalya Nisan 2008

slide2
Amaç
  • Deneysel araştırmada in vitro yöntemler ve kullanım alanları konusunda genel bilgi sahibi olma
  • Solunum yolunun hücre dizileri ile primer hücre kültürlerinin elde ediliş yöntemleri hakkında bilgi sahibi olma
  • Bu kültürlerin araştırmalarda sunduğu olanaklar ile kullanılan yöntemler hakkında bilgi sahibi olma
  • Katılımcıları bu yöntemleri öğrenme ve kullanmaları konusunda teşvik etme
sunu ak
Sunu Akışı
  • Giriş;
    • Araştırma laboratuarı
    • Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?
  • Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri
  • Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı
  • Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı
  • Özet
sunu ak1
Sunu Akışı
  • Giriş;
    • Araştırma laboratuarı
    • Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?
  • Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri
  • Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı
  • Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı
  • Özet
n vitro ara t rma laboratuar
İn Vitro Araştırma Laboratuarı
  • Nasıl kurulur?
  • Kaynak; DPT, Üniversite fonları, TÜBİTAK
  • Profesyonel destek
  • Personel; biyolog, teknisyen, asistan
n vitro y ntemler nerede kullan l r
İn vitro yöntemler nerede kullanılır?
  • İn vivo koşullarda alınan bir örneğin incelemesi;
    • Periferik kan, idrar, dışkı, BOS vs.
    • Ekspirasyon havası, balgam, biyopsi, BAL
    • Deney hayvanlarından alınan örnekler; kan, hava yolu-akciğer sıvıları, akciğer dokusu
  • İn vitro koşullarda doku ve hücre kültürü elde edilmesi ve incelenmesi
    • Periferik kan kültürleri; mono nükleer hücreler, eozinofil vs
    • Hava yolu hücre kültürleri; Hücre dizileri, primer hücre kültürleri vs
n vitro y ntemler ni in kullan l r
İn Vitro Yöntemler Niçin Kullanılır?
  • Bir enzim, elementin direkt ölçümü; ALT, AST, Na, K vs
  • Hücre fonksiyon/bütünlüğünün araştırılması; silya titreşimi, elektriksel direnç, permabilite
  • Hücrenin canlılığı; MTT (tetrazolium tuzu), trypan blue
  • Anahtar bir proteinin belirlenmesi; ELISA, Western Blot
  • Gen düzeyindeki bozukluk/aktivasyonunun incelenmesi: PCR, RT-PCR
  • Bir protein/antijenin ekspresyonu; immüno-sito kimya
  • Hücrelerin (büyüklük/eksprese ettiği belirtece göre) ayrılması/belirlenmesi; akım sitometri (‘flow cytometry’)
sunu ak2
Sunu Akışı
  • Giriş;
    • Araştırma laboratuarı
    • Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?
  • Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri
  • Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı
  • Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı
  • Özet
enzyme linked immunosorbent assay elisa enzyme immunoassay eia
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)/Enzyme ImmunoAssay (EIA)

(Substrat)

(‘enzime bağlı

secondary ab’)

(‘detecting ab’)

(Nümune)

(‘capture ab’)

immunosito histokimya
ImmunoSito/Histokimya

Enzimatik Yöntem

Floresan Yöntemi

blotting leke
‘Blotting’ (leke)
  • Southern blot; DNA dizisi (sequence,sekans)
  • Western blot; protein antibody ile
  • Northern blot; gen ekspresyonu RNA ile
  • Southwestern blot: DNA bağlı protein
  • Far-western blot: Protein, non-antibody protein ile

http://en.wikipedia.org/wiki/Southern_blot

western blot immunoblot
Western Blot (Immunoblot)
  • Doku homojenatı/ekstraktı, hücre
  • Spesifik proteini, düzeyini belirlemek
microarray mikrodizi
Microarray (Mikrodizi)
  • DNA microarray’leri; cDNA microarray, oligonucleotide microarrays
  • Protein mikroarray
  • Tissue mikroarray
  • Transfection mikroarray (hücre microarray)
  • Kimyasal bileşik mikroarray
  • Antibody mikroarray
  • Gene Chip Analizleri
dna mikroarray
DNA Mikroarray
  • Gen/genom chip, DNA chip, gen array
  • Tek bir geni temsil eden mikroskobik DNA spotlarının bir kolleksiyonu
  • Diğer arraylar’dan farkı ya DNA’yı ölçer, ya da ölçüm sistemlerinin bir parçası olarak DNA’yı kullanırlar.
genomic
Genomic
  • Bir organizmanın bütün genomunun araştırılması
  • Organizmaların bütün DNA dizilerinin(sekans)
  • tespitine dayalı çalışmalar
proteomic
Proteomic
  • ‘Genomic’ ile analoji yaratmak amacıyla kullanılır
  • Genel olarak protein çalışmaları
  • (yapı ve fonksiyonları)
  • ‘Proteome’; ‘protein’ ve ‘genome’ dan oluşur.
    • Bir organizma tarafından üretilen tüm proteinler
small interfering rna sirna
Small Interfering RNA (siRNA)
  • ‘short interfering RNA’veya‘silencing RNA’
  • Spesifik rolleri olan 20-25 nükleotid uzunluğunda
  • çift-sarmal RNA moleküllerinden oluşur.
  • siRNA transfeksiyon yoluyla hücreye verilerek
  • Spesifik geni etkisizleştirme de (knock down)
  • kullanılabilir
flow cytometry
Flow Cytometry
  • DNA (hücre siklüsü, proliferasyonu vs)
  • Apopitozis çalışmalarında
  • Hücre yüzey antijenlerinin belirlenmesinde (CD markerları)
  • Hücre içi antijenler (sitokin, mediatör vs)
  • Kromozom analiz ve tespitinde
  • RNA çalışmalarında
  • Protein ekspresyon ve lokalizasyonunda
slide25

http://www.bdbiosciences.com/immunocytometry_systems/

support/training/online/ITF/index.shtml

ak m sitometri flow cytometry
Akım Sitometri (Flow Cytometry)
  • Tek dalga ışın demeti(lazer)
  • sıvı akımına yönlendirilir
  • Çevredeki detektörler ışığın
  • kırılma yönü, yaydığı
  • floresan ışığının tespitiyle hücre/partiküllerin belirlenmesi esasına dayanır
sunu ak3
Sunu Akışı
  • Giriş;
    • Araştırma laboratuarı
    • Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?
  • Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri
  • Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı
  • Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı
  • Özet
h cre k lt rleri
Hücre Kültürleri
  • İn vivo uygulamalarda etik, güvenlik sorunları
  • Uygun çalışma modeli
  • Hücre fizyolojisi, biyokimyası vb
  • Patogenez; rinit, astım, KOAH, kanser
  • Toksikoloji; kimyasallar, zehirler, çevresel irritanlar (hava kirliliği), biomas
  • Terapötik; Ca tedavisi, steroidler, 2-agonist, teofilin, yeni ajanlar, vs
h cre dizileri cell line
Hücre Dizileri (‘Cell line’)
  • Normal hücreler (ölümsüz) ‘immortal’ hale getirilirler (viruslar, SMV40);
    • BEAS-2B (Bronş epitel hücreleri)
    • 16 HBE-14o- hücreleri (Bronş epitel hücreleri)
  • Kanserleşmiş hücreler kullanılır
    • A549 hücreleri (akciğer karsinoma hücreleri)

NHLI Cell Culture Protocols, American Type Culture Collection

slide31

DMEM,%10 FCS, 2mM L-glutamine

  • Tek katman (‘monolayer’) oluşturur

A549 (İnsan Alveolar Epitel Hücreleri)

(Hoffman Modüle Kontrast Mikroskobu x400)

h cre canl l mtt
Hücre Canlılığı - MTT

50

100

200

400

SF

FCS

%10

5

10

Dizel Egzoz Partikülleri (g/ml)

slide34

24 saat

DEP’nin A549hücre canlılığı üzerine etkisi

***p<0.0001-0g/ml DEP

72saat

48saat

slide37

DEP (10g/ml)’nin A549 hücre apoptozisine etkisi

SF

*P<0.05 and

**P<0.005 vs SF

Bayram H et al, Eur Respir J 2006

dep nin a549 h cre p21 cip1 waf1 protein ekspresyonuna etkisi
DEP’nin A549 hücre p21CIP1/WAF1 protein ekspresyonuna etkisi

DEP (g/ml)

10%

FCS

0 1 10

p21CIP1/WAF1

-actin

*

**

*P<0.05 and

**P<0.01 vs 0g/ml DEP

10% FCS

slide39

DEP (10g/ml) ile 48 saat inkübasyonun A549 hücre p21CIP1/WAF1 mRNA ekspresyonuna etkisi

*P<0.05vs SF

sunu ak4
Sunu Akışı
  • Giriş;
    • Araştırma laboratuarı
    • Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?
  • Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri
  • Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı
  • Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı
  • Özet
primer h creler avantajlar
Primer Hücreler-Avantajlar
  • İn vivo ortamdaki hücrelerle genotipik ve fenotipik benzerlik
  • Çeşitli patolojilerde, hastalardan direkt olarak elde edilebilirler
primer h cre k lt r dezavantajlar
Primer Hücre Kültürü-Dezavantajlar
  • Elde edilmeleri daha zor
  • Tekrar tekrar çoğaltılıp kullanılamazlar
  • Etik sorunlar
doku h cre kayna
Doku - Hücre Kaynağı
  • Cerrahi eksplant
    • Pnömonektomi, Lobektomi
    • Transplant akciğeri
  • Biyopsi
  • Fırçalama (epitel hücreler)
  • Enzimatik digestion,
  • Disseksiyon
  • Hazır, ticari olarak
akci erin primer h cre k lt rleri
Akciğerin Primer Hücre Kültürleri
  • Düz kas hücreleri
  • Fibroblast kültürleri
  • Alveolar epitel hücreleri
  • Bronş epitel hücreleri
primer bron epitel h cre k lt rleri
Primer Bronş Epitel Hücre Kültürleri
  • Fırçalama,
  • Enzimatik digestion,
  • Disseksiyon
k lt r vasat
Kültür Vasatı
  • ‘Medium 199’
    • Foetal bovine serum (2.5ml)
    • 1ml bovine pancreatic insulin (2.5 g/ml)
    • 1ml human transferrin (2.5 g/ml)
    • 1ml epidermal growth factor (20g/ml)
    • 1ml hydrocortisone (0.36 g/ml)
    • 1ml L-glutamine (0.02mg/ml)
    • 1ml antibiyotik/antimikotik solüsyon
  • 100ml tamamlanır ve 0.2m por çap filtreden geçirilir
k lt r kaplar
Kültür Kapları

6cm çaplı, Falcon ‘Primaria®’’ plastik

kültür kapı (Becton Dickinson,UK)

9mm çaplı 24 gözlü, 0.45m por

çaplı hücre kültür ‘insert’ diagramı

slide50

1. Hafta

3. Hafta

(Hoffman Modulation Contrast Işık Mikroskopu, x300)

slide53

DEP’nin bronş epitel hücre silya titreşim frekansına etkisi

Bayram H, et al. Am J Respir CellMol Biol 1998.

slide54

Normal kültür ortamında astmatik ve non-astmatik bronş epitel hücrelerinden inflamatuar mediatör salınımı

pg/g selüler protein

Non-ast.

Ast.

p<0.05

(log.)

p<0.003

p<0.002

YK

IL-8 GM-CSF RANTES sICAM-1

Bayram H, et al. J Allergy Clin Immunol 1998.

slide57
Ozon ve NO2’e 2-6s maruziyetin atopik astmatik bronşepitel hücre kültürlerinin elektrik direncine etkisi

Bayram H, et al. Clin Exp Allergy 2002.

sunu ak5
Sunu Akışı
  • Giriş;
    • Araştırma laboratuarı
    • Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?
  • Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri
  • Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı
  • Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı
  • Özet
slide59
Özet
  • Bir araştırma laboratuarı kurmakla başlanmalı
  • İn vitro yöntemler çok çeşitli araştırmalarda kullanılabilirler
  • Akciğer hücre dizi ve primer hücre kültürleri yapılabilir
  • Solunum yolu hücrelerinin
    • Fizyolojik
    • Biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi
    • Çeşitli patolojilerdeki rollerinin aydınlatılmasında kullanılabilir
yorum
Yorum
  • Bütün dünyada yaygın olarak kullanılan in vitro araştırma yöntemlerinden yararlanmalıyız