Alfredo Alder , Eva M. Golet, Irene Xifra, Adrian Strehler, Thi Ngoc Anh Pham, Walter Giger

1. Fluoroquinolones - Antibiotiques dans les eaux usées, les boues d‘épuration et les eaux de surface Alfredo Alder, Eva M. Golet, Irene Xifra, Adrian Strehler, Thi Ngoc Anh Pham, Walter Giger EAWAG, CH-8600 Dübendorf

2. Index • Introduction • Méthodes analytiquesEaux usées, Boues d’épuration • Présence et comportement- Eaux usées provenant d’hôpitaux- Flux dans la STEP Zürich-Werdhölzli-Présence et comportement dans le Glattal • Évaluation du risque • Résumé

3. Analyses dans l’environnement (Monitoring) 1976: 1-2 µg/L d’acide clofibrique & salicilique dans des STEPs Garrison et al., Athens, EPA. 1985: jusqu’à 1 µg/L de résidus de médicaments dans des STEPs et des eaux de surface Richardson & Bowron, London. depuis 1995: 80 médicaments ont été analysés dans les eaux de surface Ternes, Stumpf, Hirsch et al., Wiesbaden. 2001 Analyse de 60 médicaments dans les eaux souterraines (D) Sacher et al. J. Chromatogr. A 938, 199-210 2002 Analyse de 95 médicaments dans les eaux de surface(USA) Kolpin et al. ES&T 36, 1202-1211

4. Concentrations faibles dans l‘environnement 2 à 3‘000 substances (médecine humaine et vétérinaire) Les médicaments sont utilisés:- pour déclencher une réaction biochimique spécifique - pour un organisme spécifique - pendant une période définie mais, Quel est l‘importance d‘une contamination des écosystèmes aquatiques par ces substances?- des modifications progressives et peu manifestes? - des impacts à long terme?

5. Voies des émissions

6. Voies des émissions

7. Objectifs Eaux usées des hôpitaux  STEP  Eaux de surface • Mise en place des méthodes analytiques • Détermination des flux:-Les émissions dans les STEPs et dans les eaux de surface- Interprétation des processus • Informations pour l‘évaluation du risque:- PEC, "MEC” - Apparition de résistances

8. Consommation des antibiotiques en Suisse 120 100 Consommation totale 80 Additifs dans les produitsfourragères: Stimulateurs de performancesantimicrobiennes et alimentsmédicamenteux 60 Tonnes 40 Médecine humaine 20 Médecine vétérinaire *interdits depuis 1999 0 1995 1996 1997 1998 1999 2000 Treuhandstelle der Antibiotika-Importeure und BLW

9. Consommation des antibiotiques en médecine humaine en Suisse (1997, TSA) 13.2 t Pénicillines &Ampicillines 4.3 t Cephalosporines 2.3 t autres 1.0 t Tetracyclines 5.5 t Sulfonamides 4.0 t Fluoroquinolones 4.3 t Macrolides

10. Fluoroquinolones Norfloxacine(NOR) Ciprofloxacine(CIP) Quinolone: la structure

11. Importance pour l‘environnement - 1 • Consommation:- env. 4.8 t (CH 1999) - CIP et NOR représentent env. 90 % de tous les FQs • Inhibition de la Gyrase microbienne • Excrétion des substances non métabolisées pour la plus grande partie- CIP env. 45% dans l’urine, 25% dans les fèces - NOR env. 30 % dans l’urine, 28 % dans les fèces

12. Importance pour l‘environnement - 2 • Propriétés physico-chimiques:- PkCOOH: 6-7; pKNH2:8-10 Þ molécule portante une charge positive et négative à pH neutre - log Kow: -1.03 - 0.28 - log Kd (boues): 4.3 L/Kg (CIP) Þ Adsorption élevée • Comportement dans l‘environnement:- non dégradable par les bactéries - photodégradable

13. Détermination dans les eaux usées et dans les eaux de surface Enrichissement: SPE (échangeur de cations, MPC), pH 3Élution avec 5% de NH3aqueux dans méthanol HPLC/FLD: Colonne RP-Amide (250 x 3 mm), Phosphate / ACN gradient HPLC/MS: Colonne RP-C18 (250 x 2 mm)0.1% TFA / ACN gradient Détection: Fluorescence: Ex: 278 nm, Em: 445 nmMS: Platform LC (Micromass), +ESIMS/MS: API 365 (Sciex) +ESI Litérature: Golet et al. (2001) Anal. Chem. 73, 3632-3638

14. Détermination dans les boues et dans le sol Extraction: ASE (Accelerated Solvent Extraction)50 mM H3PO4 / ACN : 1 / 1100 °C, 100 bar; 4 x 15 min Enrichissement:SPE (échangeur de cations, MPC), pH 3 Elution avec 5% de NH3aqueux dans méthanol HPLC/FLD: RP-Amide (250 x 3 mm), Phosphate / ACN Gradient Detektion: Fluorescence: Ex: 278 nm, Em: 445 nm Literatur: Golet et al. (2002) Anal. Chem. 74, 5455-5462

15. Accelerated Solvent Extraction (ASE)

16. Chromatogramme d’un extrait de boues

17. Extraction séquentielle Boues d‘épuration Pourcentage extrait Nombre d‘extractions Sol (traîté avec des boues) Pourcentage extrait Nombre d‘extractions

18. Concentrations dans les boues mg/kg MS Matrice Ciprofloxacin Norfloxacin ± ± Boues fraîchesa D ü bendorf 1.40 0.12 1.54 0.03 ± ± Zürich-Werdhölzli 2.03 0.20 1.96 0.15 ± ± Boues stabiliséesa Kloten-Opfikon 2.42 0.06 2.37 0.07 ± ± Zürich-Werdhölzli 2.27 0.20 2.13 0.19 ± ± Sol (traîté avec des boues)b Wetzikon 0.35 0.04 0.32 0.01 (t = 5 mois) ± ± Reckenholz 0.40 0.03 0.29 0.01 ± ± Sol (traîté avec des boues)b Wetzikon 0.28 0.01 0.27 0.01 (t = 21 mois) ± ± Reckenholz 0.27 0.04 0.30 0.01 a Conditions ASE : 100 °C, 100 bar, 4 x 15 Min. b Conditions ASE : 100 °C, 100 bar, 6 x 15 Min.

19. Antibiotiques dans les eaux usées provenant d‘hôpitaux

20. Variabilité des concentrations dans les eaux usées provenant d‘hôpitaux heure (h)

21. STEP Zürich-Werdhölzli

22. Ciprofloxacine dans des échantillons globaux journaliers Eaux uséesEffluents décantation primaireEffluents décantation secondaireEffluents filtration Flux [g/j] merc jeudi ven sam dim lundi mardi Golet et al.

23. Flux de Ciprofloxacine dans la STEP Werdhölzli Golet et al.

24. Fosse pédologique

25. Fluoroquinolones dans le Glatt STEPs [g / jour] [g / jour] Golet et al., 2002

26. Fluoroquinolones dans le Glatt STEPs [g / jour] [g / jour] Golet et al., 2002

27. Emissions de Ciprofloxacinvers le Glatt Flux dansles eaux uséesGlatt Flux (g/j) Distance (km) Golet et al., 2002

28. Fluoroquinolones dans les eaux usées Eaux (hôpitaux) Eaux usées Affluents biologie Effluents filtration Glatt Concentrations [μg/l]

29. Evaluation du risque (Ciprofloxacine) • Algues (Selenastrum capricornutum):EC50: 3 mg/L (inhibition de la croissance) EU-TGD (eaux de surface): facteur de sécurité 1‘000 ÞPNEC 3 µg/L • Bactéries (Pseudomonas putida): EC50: 80 µg/l (inhibition de la croissance)EU-TGD (STEP): facteur de sécurité 10 ÞPNEC 8 µg/L • umuC-Genotoxicité LOEC: 5 µg/L(Hartmann et al., 1998) • „CIM“ (Concentration d’inhibition minimale): LOEC:10 µg/LFacteur de sécurité 10 (variabilité entre les éspèces)ÞPNEC 1 µg/L

30. Fluoroquinolones dans les eaux usées PNEC Eaux (hôpitaux) Eaux usées Affluents biologie Effluents filtration Glatt Concentrations [μg/l]

31. Distribution de résistances aux antibiotiques ? ? ? Est-ce que les émissions d‘antibiotiques dansl‘environnement contribuent aux résistances?

32. Méthode: Antibiogramme Sensible Résistent intermédiaire INTERPRETATIVE STANDARDS CIPROFLOXACIN Résistent < 15 mm Intermédaire = 17 mm Sensible > 21 mm Corvaglia, Demarta, Gaia, Peduzzi (2002) Istituto Cantonale di Microbiologia, Bellinzona

33. Concentrations - résistances Aeromonas, AntibiogrammResistance aux Ciprofloxacin hôpital 1 hôpital 2 hôpital 3 hôpital 4 40 30 Sensible Intermédiaire Résistant 20 Diamètre [mm] 10 0 0 5 10 15 Concentrations [µg/L] Unpublished results (2002)EAWAG, Dübendorf and Istituto Cantonale di Microbiologia, Bellinzona

34. Résumé • Mise en place de méthodes analytiques spécifiques, QS • Détermination des flux dans des systèmes techniques et naturels • Mise en place d‘études régionales • Interprétations d‘après les processus • Utilisation de méthodes chimiques combinées avec des „endpoints“ biologiques (p.ex résistance aux antibiotiques) • Aucuns impacts aiguës pour les écosystèmes sont causés par les antibiotiques.

35. Pour des informations supplémentaires • European Agency for the Evaluation of Medicinal Products: http://www.emea.eu.int • U.S. Environmental Protection Agencyhttp://www.epa.gov/nerlesd1/chemistry/pharma/index.htm • Food and Drug Administrationhttp://www.fda.gov • Bund/Länder-Ausschuss Chemikaliensicherheit (BLAC), Hamburghttp://www.blac-info.de • Institut für Veterinärpharmakologie und -toxikologiehttp://www.vetpharm.unizh.ch • http://www.snf.ch/NFP/NFP49/Home_d.html • http://www.bag.admin.ch