第八 章 基因诊断 Gene Diagnosis

1. 第八章 基因诊断 Gene Diagnosis

2. 人类疾病的原因 • 内因： 基因结构改变（基因突变）——点突变、插入、缺失、重排、易位、基因扩增 基因结构多态性 基因表达异常 • 外因： 病原体的侵入

3. 对于疾病的诊断依据： • 临床表现 • 实验室诊断技术： 细胞学检查 生物化学代谢产物和酶的活性变化检查 免疫学检验 基因诊断

4. 一、基因诊断概述 (一) 基因诊断的概念与特点 (二) 基因诊断的基本原理与临床意义

5. (一)基因诊断的概念与特点 1．概念： 指利用分子生物学技术，从DNA或RNA水平检测基因的存在、分析基因的结构变异和表达状态，对疾病作出诊断的方法和过程。 • 基因诊断以DNA和RNA为诊断材料， • DNA诊断 • RNA诊断

6. 2．基因诊断的特点： （1）直接检测基因，属病因诊断，针对性强； （2）特异性强、灵敏度高：由于基因诊断采用核酸分子杂交、聚合酶链反应等技术； （3）适用范围广：其应用的范围已从原先局限的遗传性疾病扩大到感染性疾病、肿瘤、心血管疾病等领域。

7. 基因诊断的评价 • 特异性 • 灵敏度 • 重复性 • 快速 • 经济

8. (二)基因诊断的基本原理与临床意义 1．基本原理： 通过检测致病基因（包括内源基因与外源基因）的存在、量的多少，结构变化与否及表达水平是否正常，以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化，以此作为疾病确诊的依据。 2．临床意义: • 对有表型出现的疾病作出明确诊断 • 早期快速诊断 • 确定个体对疾病的易感性 • 疾病的分期分型、疗效监测、预后判断等

9. 二、基因诊断的常用技术与方法 (一) 基因诊断的常用技术 (二) 基因诊断的基本方法

10. (一)基因诊断常用技术 • 核酸分子杂交 • PCR（聚合酶链式反应） • 限制性酶切分析 • SSCP（单链构象多态性分析） • DNA 测序 • DNA 芯片技术

11. 基因诊断技术分类 1、Molecular hybridization： Southern, Northern, dot blot, 2、PCR 3、DNA测序 4、DNA芯片技术

12. 1. 核酸分子杂交Molecular hybridization • Southern blot——DNA • Northern blot——RNA • Dot blot， • In Situ Hybridization,

13. 核酸杂交的基本原理： 利用核酸变性和复性理论：（1）双链DNA分子在某些理化因素作用下解旋，条件恢复后又可恢复其双螺旋结构；（2）具有互补碱基序列的异源核酸单链之间同样可按碱基互补配对原则通过氢键结合为双链。

14. 核酸分子杂交的流程示意图 • 待测核酸制备 • 制备探针核酸片段 滤膜上核酸固化 探 针 标 记 杂 交 加入标记核酸探针 去除未参与杂交的探针 检 测 杂 交 信 号

15. 探针的种类 • DNA探针:基因组DNA探针;基因探针 • cDNA探针:目前应用最广泛的 • 寡核苷酸探针(Oligonucleotide probes) • RNA 探针:

16. 不同的探针在应用中有各自的特点,但最重要的是探针的序列选择.而探针序列又是依据待测核酸序列选择的。不同的探针在应用中有各自的特点,但最重要的是探针的序列选择.而探针序列又是依据待测核酸序列选择的。 　　对致病性微生物应选用其最保守、最特异的序列；对突变基因的检测，应用含有突变位点的序列或待测基因编码的ｍＲＮＡ序列。

17. 探针的标记物 • 放射性标记物 • 32P，35S，125I，3H • 非放射性标记物 • 生物素，地高辛，荧光素， 酶， 金属

18. Southern blot N T T N T T N

19. 1、Southern blot：用于DNA检测，不但能检测出特异的DNA片段，还能进行定位和测定分子量，可用于基因的限制性内切酶图谱分析、基因突变分析等。 2、Northern blot：杂交用于RNA检测，能对组织细胞中的总RNA或mRNA进行定性和定量分析。 3、dot blot：既可检测DNA也或检测RNA，用于基因组中特定基因及其表达的定性和定量分析。缺点：特异性较低，不能鉴定所分析的基因分子量。 4、原位杂交：在组织、细胞和染色体水平作核酸定性和定量分析，并可定位。

20. （二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术 PCR是在试管内利用DNA聚合酶催化的反应反复进行同一段DNA片段合成的过程

21. PCR技术的优点 • 特异性强 • 灵敏度高 • 操作简单、省时 • 对待检原始材料质量要求低 • 高效率的基因扩增技术

22. 1、直接采用PCR技术进行基因诊断 通过PCR技术扩增特异性的基因，可以确定病原生物基因是否存在或分析疾病相关的体内基因缺失或基因突变

23. 2、采用PCR产物的限制性片段长度多态性分析 （PCR－RFLP） 　　基因突变导致的基因碱基组成和顺序发生改变，会在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有限制性内切酶位点消失。因此，突变基因经相应的限制性内切酶水解后，其电泳条带的数量和大小就会发生改变，根据这些改变可以判断突变是否存在。即限制性片段长度多态性技术。 PCR－RFLP就是利用PCR技术先将包含待测位点的DNA片段扩增出来，然后用识别该位点的限制性内切酶水解，根据限制性片段数量和长度作出诊断。

24. 3、采用PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术3、采用PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术 等位基因特异性寡核苷酸探针技术（ASO）原理： 针对已知突变位点的基因，可以分别针对已知突变位点的序列，设计一对寡核苷酸探针，其中一条为野生型探针，与无突变序列互补，另一个为突变型探针，与突变序列互补。同时设计探针时，突变碱基应位于探针的中央，这样在严格控制杂交和洗脱条件下，只有完全互补的探针保留下来，形成稳定杂交分子，而中央碱基与靶序列不匹配的探针则被洗脱。

25. 采用PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术采用PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术 PCR/ASO则是采用PCR扩增受检者基因的目标片段，并与相应的ASO探针杂交，如果受检者DNA扩增的产物与正常探针杂交，而不与突变探针杂交，表示受检者不存在突变基因；如果只有突变探针可以杂交，说明突变基因为纯合子；如果两者都存在，则说明突变基因为杂合子。

26. βΑ/βΑ βΑ/βS βS/βS 正常探针 突变探针

27. 4、PCR产物的反相点杂交分析技术 此项技术与PCR/ASO技术原理完全相同，只是杂交时采用的是反相杂交。是将探针固定在膜上成为固定相，用PCR产物作为液体相，进行杂交实验。

28. 5、采用PCR产物的单链构象多态性分析进行基因诊断5、采用PCR产物的单链构象多态性分析进行基因诊断 单链构象多态性（SSCP）分析是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法。DNA经变性形成单链后，在中性条件下单链DNA会因其分子内碱基之间的相互作用，形成一定的立体构象。相同长度的单链DNA会因分子内碱基组成或排列顺序不同，形成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性。对长度相同而构象不同的单链DNA在非变性聚丙烯胺凝胶电泳中表现出不同的迁移率。

29. PCR-SSCP技术就是利用PCR扩增目的基因片段，通过变性成为单链，然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，单个核苷酸的改变会造成DNA片段构象的改变，其迁移率也会改变，从而检测基因的突变。PCR-SSCP技术就是利用PCR扩增目的基因片段，通过变性成为单链，然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，单个核苷酸的改变会造成DNA片段构象的改变，其迁移率也会改变，从而检测基因的突变。

31. 6、采用PCR结合变性梯度凝胶电泳技术 该技术是先制备浓度从低到高的变性剂的凝胶，然后将待测分析的PCR扩增产物进行电泳，到DNA电泳到变性剂浓度能使DNA发生变性的位置时，DNA双链分开，由于不同DNA片段的碱基组成不同，因此在凝胶中泳动发生变性的位置不同，迁移率也不同，因此可以将相同长度但碱基组成不同的DNA片段分开，从而能检测出基因的突变。

32. 7、甲基化特异性PCR技术 DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。 如在一般正常的细胞中，基因调控区CPG岛处于非甲基化状态，而当细胞发生癌变后，这些区域往往呈现甲基化状态。因此DNA甲基化研究是一热点。

33. 甲基化特异性PCR技术（ MS-PCR ） 将DNA先用亚硫酸盐处理，这样未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的不变，随后行引物特异性的PCR。在MS-PCR中设计两对引物，一对为甲基化特异性的引物（primerⅠ），一对为非甲基化的引物（primerⅡ），进行特异性的扩增，只有结合完全的甲基化或非甲基化特异性引物的片段才能扩增出产物，最终可以确定研究DNA片段部位的甲基化情况。

35. 8、采用PCR技术进行靶核酸的定量分析 • 以上介绍的基于PCR扩增技术建立的基因诊断技术，只能提供定性结果，即有无突变。但对基因表达异常的疾病，上述方法无法满足需要，还需要研究其基因的表达量上的变化分析，故还可运用PCR定量分析基因表达。 • PCR定量分析方法有：梯度（系列）稀释法、极限稀释法、非竞争性对照法、竞争抑制法 、荧光定量PCR

36. PCR扩增有限性-平台期及平台 效应（plateau effect） PCR扩增的平台效应

37. 梯度（系列）稀释法： • 在扩增检测待测样本的同时，扩增一系列稀释的已知标准（通常为质粒DNA） • 如果在该标准稀释系列范围内，扩增产物/模板成线性相关，则可推导出同时扩增的待测样本中PCR模板的相对量. • 必须在扩增的指数期进行 • 优点：简单，可作粗糙的定量分析。 • 缺点：不准确，影响因素多。

38. 改良方法：极限稀释分析 首先将原始模板进行梯度稀释; 然后对该稀释系列进行PCR扩增测定; 最低的阳性样本被认为含有与一已知的标准稀释系列中最后的阳性样本中相同量的PCR模板 基本依据：PCR扩增的有效起始模板分子数为104～106个

40. 非竞争性对照基因定量法 该定量法是靶基因与参照基因的同步扩增。即在同样的反应条件下，在一个试管内同步扩增来自同一DNA 的一段靶序列和另一段内标序列(通常是管家基因或它们的mRNA)。通过比较两种序列的扩增产物电泳带的颜色强度对靶基因定量。

41. 竞争PCR 与前述方法相似，即靶基因与参考标准在同一反应管中共同扩增，但参照标准通常是一段人工合成的模板而不是内源性基因。竞争PCR 必须构建一个内部标准，此标准能与靶基因竞争聚合酶、核苷酸和引物分子，具有相同的引物结合位点，其扩增产物能通过电泳或高效液相色谱(HPLC)等方法区分开来。 将竞争模板作系列稀释后，加入到恒量的样品DNA进行PCR，通过分离和分析竞争模板与样品DNA产量，对样品DNA进行定量分析。 竞争性PCR：

42. 3. DNAsequencing DNA序列测定是最直接、最准确的基因诊断技术

43. 例：四色荧光自动测序分析结果

45. 4.DNA芯片技术DNA chips or microarray

46. DNA芯片技术的概念 指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息） 由于在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术如显微光蚀刻、显微打印等，且常用硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片技术

47. DNA芯片技术原理 • 大规模集成的固相杂交 • 基本原理是核酸分子杂交，即依据DNA双链碱基互补配对、变性和复性的原理 • 以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性、定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息

48. 第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略 人类疾病多种多样，致病原因不同，因此在基因诊断上也有不同途径和策略。 1、对致病基因已经找到、发生机制清楚的疾病，可以通过直接检测致病基因进行基因诊断。 如：病原微生物的感染：病毒、细菌、寄生虫、真菌等，及与疾病有关的机体内源性基因：癌基因、抑癌基因、病理基因。

49. 第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略 2、对致病基因还没找到，发生机制也没有完全清楚，但致病基因已定位于染色体或基因组的特定区域的疾病，可以通过检测致病基因的联锁遗传标记进行基因诊断。 如：用限制性内切酶位点作为遗传标记，利用该遗传标记与相邻的基因在遗传过程中分离几率很低，常常一起遗传，形成连锁特点，建立了染色体基因连锁图，根据基因连锁图，通过分析连锁基因的遗传标记，可判断致病基因存在的可能性。

50. 第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略 3、对多因素、多基因疾病，可以通过检测表型克隆基因进行基因诊断。 如高血压、冠心病、肿瘤、精神病、自身免疫性疾病，由于疾病发生的原因复杂，涉及多基因、多因素。因此可采用表型克隆方法来分析诊断。 原理：从分析正常和异常基因组采用差异显示等技术找到正常人和疾病患者之间的差异序列，进行克隆。根据克隆的一组基因差异序列制作相应探针，用制备的这一组探针检测相关疾病的方法。