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Objetivo : Conocer las técnicas básicas para el análisis de fertilidad microbiana del suelo

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PRÁCTICO N° 3. Análisis de fertilidad de los suelos. Objetivo : Conocer las técnicas básicas para el análisis de fertilidad microbiana del suelo. Técnicas mas utilizadas Abundancia de microorganismos Biomasa total

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slide1

PRÁCTICO N° 3

Análisis de fertilidad de los suelos

Objetivo: Conocer las técnicas básicas para el análisis de fertilidad microbiana del suelo

  • Técnicas mas utilizadas
  • Abundancia de microorganismos
    • Biomasa total
    • Determinación de grupos funcionales (fijadores de nitrógeno, celulolíticos, nitrificadores, amonificadores, etc.)
  • Actividad microbiana
    • Heterótrofa total (producción de CO2, consumo de O2)
    • Enzimas especificas( nitrogenasa, sacarosa, ureasa, amilasa)
t cnicas para determinar abundancia de microorganismos
Técnicas para determinar abundancia de microorganismos
  • Recuento de células totales
  • Método directo (visualización al microscopio, "camara de recuento")
          • Método por turbidez (Fotómetro)
recuento de c lulas viables
Recuento de células viables
  • En medios sólidos: formación de colonias en caja de Petri (UFC)

Rango entre 30 – 300 colonias

  • En medios líquidos: número mas probable (NMP) Detección del crecimiento por consumo de sustrato o formación de productos
slide4

Recuento de células viables: grupos funcionales

Grupo funcional: microorganismos que tienen procesos metabólicos semejantes, independientemente de su taxonomía

  • Procedimiento para determinar abundancia de grupos funcionales
        • 1) Suspensión y dilución de suelo
        • 2) Siembra en medios selectivos
        • 3) Determinación del crecimiento (lectura)
        • 4) Cálculo de abundancia
slide5

Análisis de grupos funcionales

2- Diluciones decimales

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1- Suspensión

X g suelo

9 ml H2O

destilada

por tubo

+

X ml H2O destilada

10°

Agitar 3 minutos

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

Recuento en medio sólido

Recuento en medio líquido

(Ca

jas Petri)

(NMP)

3- Siembra de cada grupo funcional

Organismos fijadores de N

Nitrificadores

Celulolíticos

Amonificadores

4- Incubación y crecimiento

ESTUFA

5- Lectura y cálculos

LECTURA

slide6

Suspensión de suelo

Material de trabajo

Agregar 1 g de suelo en 100 ml de H2O destilada

Tapar y agitar durante tres minutos

Suspensión de suelo

slide7

Preparación de las diluciones

Flamear un porta-pipeta

Extraer una pipeta estéril

Extraer 1ml de la suspensión de suelo

slide8

Preparación de las diluciones

Poner el ml en el tubo 10-1

Mezclar y extraer 1 ml

Poner el ml en el tubo 10-2 Continuar igual con todos los tubos

siembra en medios espec ficos amonificadores

1 2 3 4 5 6 7 8

0

Siembra en medios específicos: Amonificadores

Diluciones: -8, -7, -6

Siembrar en medio con asparagina

Incubación 28-30°C, 7días

siembra en medios selectivos celulol ticos

1 2 3 4 5 6 7 8

0

Siembra en medios selectivos: Celulolíticos

Diluciones: -5,-4,-3

Sembrar en medio líquido con papel de filtro

Incubación 28-30°C, 15 días

siembra en medios selectivos fijadores

1 2 3 4 5 6 7 8

0

Siembra en medios selectivos: Fijadores

Dilución: -3

Sembrar en medio sólido sin N

Incubación 28-30°C, 5 días

siembra en medios selectivos nitrificadores

1 2 3 4 5 6 7 8

0

Siembra en medios selectivos: Nitrificadores

Dilución: -3,-2,-1

Sembrar en medio líquido con sulfato de amonio

Incubación 28-30°C, 21 días

slide13

Siembra de grupos funcionales

  • Batería de grupos funcionales
    • suspensión de suelo
    • gradilla de diluciones
    • gradilla de nitrificadores
    • gradilla de celulolíticos
    • gradilla de amonificadores
    • caja de fijadores de N

Estufa de incubación

slide14

Síntesis del análisis de grupos funcionales

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

9 ml H2O

destilada

por tubo

+

X g suelo

10°

Agitar 3 minutos

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

X ml H2O destilada

Recuento en medio sólido

Recuento en medio líquido

(Ca

jas Petri)

(NMP)

Organismos fijadores de N

Nitrificadores

Celulolíticos

Amonificadores

ESTUFA

LECTURA

slide15

Lectura: Amonificadores (ejemplo)

Agregar reactivo Nessler

El color ocre detecta presencia de amonio

+ + + + + - - - +

6 6 6 7 7 7 8 8 8

Contar los tubos positivos

Buscar el número en la tabla de Mc. Grady

Número característico 3 2 1

Número Mas Probable (NMP) = 15

slide16

Lectura:Celulolíticos (ejemplo)

+ + + + + - - + -

3 3 3 4 4 4 5 55

Observar alteración del papel

Número característico 3 2 1

Número Mas Probable (NMP) = 15

Tipos de alteración del papel

slide17

Lectura: Fijadores (ejemplo)

(-3)

Contar colonias (entre 30-300)

Número de colonias (UFC) = 120

slide18

Lectura: Nitrificadores (ejemplo)

Agregar SO4H2 más difenilanida

El color azul detecta presencia de nitrato

+ + + + - + - - +

1 1 1 2 2 2 3 3 3

Contar los tubos positivos

Buscar el número en la tabla de Mc. Grady

Número característico 3 2 1

Número Mas Probable (NMP) = 15

slide20

Cálculos

Objetivo: llevar la lectura a expresarla en g de nuestra muestra

Nº de colonias

(caja de Petri)

Tubos

(NMP)

N en 1 ml sembrado en la caja o tubo

X en 10 ml del tubo de la dilución usada

(la más concentrada en el NMP)

X1 en 10 ml de la dilución 10°

X2 en X ml de la solución 10°

(volumen de la suspensión)

X2 en X g de suelo de la suspensión

X en 1 g de suelo

Nº de microorganismos por g de suelo

slide21

Actividades

  • Lectura de amonificadores: reacción de nessler y manejo de la tabla de Mc.Grady
  • Lectura de fijadores de N: crecimiento de colonias en caja de Petri
  • Calculo: resolver problemas de abundancia de microorganismos
slide22

Crecimiento exponencial

Nt = N0 2n

Representación

semilogaritmica

Representación

aritmética

Crecimiento bacteriano

Cálculos de tiempos de generación

N = N0 2n

Log N = log N0 + n log 2

n = log N – log N0

log 2

g = t / n

N = número final de células

N0 =número inicial de células

n = número de generaciones

g = tiempo de generación

t = horas o minutos de crecimiento exponencial

curva de crecimiento

Logaritmo del número de células

Fase

de

latencia

Fase estacionaria

Tiempo

Fase exponencial (logarítmica)

Fase de muerte

Curva de crecimiento