OOCYTY MYSZY STOPNIOWO ROZWIJAJĄ ZDOLNOŚĆ DO AKTYWACJI W CZASIE BLOKU METAFAZY II

1. OOCYTY MYSZY STOPNIOWO ROZWIJAJĄ ZDOLNOŚĆ DO AKTYWACJI W CZASIE BLOKU METAFAZY II Jacek Z. Kubiak

2. Wprowadzenie • W normalnych warunkach dojrzałe oocyty są zapładniane w czasie bloku metafazy II (MII). • Wniknięcie plemnika powoduje ukończenie II podziału mejotycznego, wyrzucenie II c.k. i przejście do interfazy. • Niedojrzałe oocyty nie są zdolne do aktywacji przez wniknięcie plemnika. Jądro plemnika nie tworzy wtedy przedjądrza, jego DNA tworzy grupki silnie skondensowanej chromatyny. • Wniknięcie plemnika w czasie prometafazy lub metafazy I prowadzi do powstania skondensowanych chromosomów z jądra plemnika

3. Wprowadzenie c.d. • Zachowanie chromatyny oocytu i plemnika po wniknięciu w M I zależy od liczby plemników: • Monospermia lub oligospermia może opóźnić dojrzewanie, ale prawie nie wpływa efekt końcowy: silnie skondensowane chromosomy oocytu i plemnika • Wysoka polispermia powoduje najczęściej przejście do iterfazy • 4-6 plemników daje efekt pośredni (zwykle blokada w MI, chromosomy oocytu skondensowane, jądro plemnika nie tworzy chromosomów) • Oocyty w Metafazie I mogą być zatrzymane w interfazie przez puromycynę lub cykloheximid (inhibitory syntezy białek) • Inhibicja syntezy białek w M II prowadzi do aktywacji partenogenetycznej

4. Cel doświadczeń Pokazanie, że: • oocyty stopniowo osiągają zdolność do aktywacji w czasie bloku M II • dojrzewanie jądra i cytoplazmy to 2 osobne procesy • czas nabycia zdolności do aktywacji zależy od czynnika pobudzającego oocyt

5. Zastrzyk z PMSG 48-52 godz. Zastrzyk z HCG 10-10,5 godz. Wykłuwanie oocytów z jajników Wydobycie oocytów z jajowodów powyżej 11 godz. Pożywka M2+BSA Materiały i metody Otrzymanie oocytów zatrzymanych w MII:

6. Usunięcie osłonki przejrzystej (kwaśny roztwór Tyrode’a, -chymotrypsyna lub 0,5% pronaza) Usunięcie I c.k. (delikatne pipetowanie) Wykłucie oocytów z pęcherzyków jajnikowych 4-tygodniowych myszy z F1 Działanie roztworem 8% etanolu (6,5 min) Płukanie w pożywce M2 Hodowla w pożywce M2 pod płynną parafiną (37ºC, 5%CO2) Hialuronidaza (usunięcie komórek pęcherzykowych) Hodowla w pożywce Witttena pod płynną parafiną (37ºC, 5%CO2) Aktywacja partenogenetyczna: Dojrzewanie in vitro:

7. Kapacytacja (1 godz. W pożywce Whittinghama, pod płynną parafiną; 37ºC, 5%CO2) Rozcieńczenie zawiesiny plemników (106 plemników/ml) Wymieszanie z oocytami pozbawionymi osłonki przejrzystej (10 min.; dla polispermii zwiększenie koncentracji plemników lub dłuższy czas inkubacji) Hodowla w pożywce M2 pod płynną parafiną (37ºC, 5%CO2) Zapłodnienie in vitro: • Z oocytów wykonywano białkowe preparaty totalne barwione hematoksyliną i suszone preparaty barwione barwnikiem Giemzy

8. Wyniki • Oocyty używane w doświadczeniach były poddawane aktywacji w czasie od 11 do 21,5 godzin po wstrzyknięciu HCG • In vivo oocyty są zapładniane między 13 a 18 godziną •  Czas aktywacji w przeprowadzonych doświadczeniach zawiera cały naturalny okres zapłodnienia

9. Rys. 1 (lewa strona) Typy reakcji oocytów na aktywację partenogene-tyczną: pozostanie w MII; stadium „MIII” – płytka metafazalna utworzona przez pojedyncze chromatydy (kilka płytek zawierało nieprawidłową liczbę chromatyd – hipohaploidalne lub hiperhaploidalne); niektóre oocyty wciągnęły IIc.k. 2-3 godz. po wyrzuceniu („stadium 40 chromatyd); stadium jąder telofazowych (gęste skupienia chromatyny w oocycie i II c.k.); stadium jądra retikularnego; stadium przedjądrza (prawidłowe przejście do interfazy) Aktywacja partenogenetyczna • Preparaty z oocytów wykonywano 5-7 godzin po aktywacji etanolem (czas wystarczający, aby oocyty utworzyły przedjądrza)

10. Rys. 2 Nieprawidłowe reakcje oocytów na bodziec partenoge-netyczny: A) Oocyt w stadium M III (preparat totalny); B) Oocyt MIII: 20 pojedynczych chromatyd (preparat suszony); C)stadium 40 chromatyd (preparat suszony); D)Stadium jądra telofazowego: wyraźnie wybarwione grupy chromatyny w oocycie i II c.k. (preparat totalny); E) Oocyt MII: każdy chromosom składa się z 2 chromatyd Rys. Stadium przedjądrzy

11. Wiek oocytów po wstrzyknięciu HCG Typy reakcji (% oocytów)) Całkowita liczba oocytów M II Stadium 40 chroma-tyd M III Jądro telofazowe Jądro retikularne Stadium przedjądrzy 11 57,6 1,7 35,6 1,7 - 3,4 59 13 3,6 1,3 48,2 1,3 - 45,6 224 16 1,9 - 7,6 13,3 7,7 69,5 105 17,5 - 1,8 3,5 5,4 1,8 87,5 56 21,5 - - - - - 100 91 Tab. 1 Typy odpowiedzi oocytów na partenogenetyczną aktywację w zależności od wieku oocytów po wstrzyknięciu HCG • Częstość pojawiania się danej reakcji oocytu zależała od czasu, jaki minął od zastrzyku HCG • Zdolność oocytów do prawidłowej aktywacji partenogenetycznej jest uzyskiwana stopniowo w czasie bloku M II • Po 17,5 godzinach ciągle istotna część oocytów (12,5 %) reaguje nieprawidłowo

12. Zapłodnienie in vitro • Rys. 1 (prawa strona) Typy reakcji oocytów na pobudzenie przez plemnik: pozostanie w M II (brak reakcji); M III (wyrzucenie II c.k. i zatrzymanie w metafazie); stadium jądra telofazowego; stadium przedjądrzy • Brak stadium 40 chromatyd i stadium jądra retikularnego. • Nieprawidłowa reakcja tylko w przypadku aktywacji po 11 i 12 godzinach; aktywacja od 13 godziny powodowała normalną aktywację oocytu • Oocyty zapładniane in vitro między 13 a 17 godziną tworzą przedjądrza • W doświadczeniu badano zachowanie oocytów zapładnianych między 11 a 13 godziną

13. Rys 3. (A-C) Chromatyna w oocytach myszy zapłodnionych na początku bloku M II (preparaty suszone); A) Chromosomy plemnika przypominające profazę 6 godzin po zapłodnieniu, w oocycie widać było też chromatydy stadium M III; B) 2 grupy chromosomów 8 godzin po zapłodnieniu (reakcja oocytu: M III); C) Dispermia; reakcja oocytu (8 godz. po zapłodnieniu): widać 3 skupienia chromatyny wewnątrz oocytu.

14. Tab. 2 Typy reakcji oocytów na zapłodnienie in vitro w różnym czasie po zastrzyku z HCG

15. Reakcje oocytów na wniknięcie różnej liczby plemników • Monospermia: w przeciwieństwie do aktywacji partenogenetycznej, już w 11 godzinie po wstrzyknięciu HCG większość oocytów zareagowała prawidłowo; po 12 godzinach wzrosła liczba prawidłowo reagujących oocytów • Dispermia: tylko w 11 godzinie pojawiły się nieprawidłowe reakcje • Polispermia: badano tylko reakcje oocytów zapładnianych w 11 godzinie po wstrzyknięciu HCG. Z 57 oocytów tylko 1 nie przeszedł do interfazy (nie utworzył przedjądrzy): trispermia – oocyt zatrzymał się w M III, pozostałe trispermie – powstały przedjądrza. Powyżej 5 plemników:powstawało tylko 1 przedjądrze,pozostałe jądra plemników zablokowane w rozwoju (chromatyna pozostała skupiona) • Oocyty stopniowo uzyskują zdolność do aktywacji • Różne bodźce mają różną siłę: polispermia jest mocniejszym sygnałem niż monospermia, a monospermia niż aktywacja alkoholowa

16. Stadium M III • Stadium to jest osiągane, kiedy oocyt jest w stanie wyjść z bloku M II i ukończyć podział, ale nie jest w stanie przejść do interfazy • Po 2-3 godzinach od wyrzucenia II c.k., odpada ono bardzo łatwo od oocytu • Czy blok M III jest podobny do M II? Doświadczenia: • 43 oocyty oocyty zatrzymane w M III poddano ponownemu działaniu etanolu 8% 2,5-4 godz. po pierwszej aktywacji. Większość (40 oocytów nie zareagowała: pozostała w M III), 2 utworzyły przedjądrza, a 1 zatrzymał się w M IV. • Oocyty zatrzymane w M II (traktowane etanolem 14 godz. po wstrzyknięciu HCG) 5 godzin później ponownie poddano działaniu etanolem. Większość (78%) pozostała w MII, pozostałe przeszły w stadia: MIII, jądro retikularne, jądro telofazowe, przedjądrza. W kontroli (oocyty 19 godz. po zastrzyku z HCG, bez wcześniejszego traktowania etanolem) większość (88,4%) utworzyła przedjądrza. •  Ponowne działanie etanolem jest mało wydajne: zarówno oocyty zatrzymane w M II jak i w M III w większości przypadków pozostają zablokowane.

17. Rys 3. (D,E) Wniknięcie plemnika spowodowało wyrzucenie II c.k.Oocyty były hodowane przez noc w obecności kolcemidu (preparaty suszone) D) Po lewej: 9 chromosomów pochodzących z aneuploidalnego przedjądrza żeńskiego (wywodzącego się z M III); po prawej: grupa chromosomów profazowych przedjądrza męskiego; E) po lewej:8 chromosomów aneuploidalnego przedjądrza żeńskiego; po prawej: chromosomy przedjądrza męskiego Doświadczenia: 3. Oocyty w M III poddano działaniu innego czynnika partenogenetycznego: puromycyny. Z 10 oocytów, 9 przeszło do interfazy. 4. Oocyty w M III poddano zapłodnieniu in vitro. Wszystkie oocyty, do których wniknął plemnik wyrzuciły III c.k.; jądra plemników uległy dekondensacji. 4 oocyty poddano działaniu kolcemidu przez noc: w 3 przedjądrza uległy rozpadowi.  Blok M III jest podobny do bloku M II i może być zwolniony po wniknięciu plemnika. Aktywacja oocytów M III powoduje rozpoczęcie ruchów anafazowych i wyrzucenie III c.k.

18. Rys.  Rola IP3 w uwolnieniu jonów Ca2+; Regulacja cyklu komórkowego w czasie mejozy Podsumowanie Oocyty myszy stopniowo uzyskują zdolność do aktywacji w trakcie bloku M II. • Doświadczenia pokazują, że ruchy anafazowe i dekondensacja chromosomów to dwa niezależne procesy: w obecności kolcemidu (brak wrzeciona podziałowego) oocyty są w stanie przejść do interfazy; w oocytach zatrzymanych w M III zaszły ruchy anafazowe, ale chromatyna nie przeszła do stadium interfazy • Autor zastanawia się nad rolą oscylacji stężenia jonów Ca2+ w dojrzewaniu oocytów (wyjściu z bloku M II). Obecnie znany jest szlak przekaźnictwa prowadzący do wzrostu stężenia jonów Ca2+, jony te przyczyniają się do rozpadu MPF.

19. Mechanizm ruchu chromosomów w czasie wyjścia z M III jest nietypowy: pojedyncze chromatydy nie mogą już być rozdzielone tak jak normalne chromosomy. • Nietypowe jest łatwe odpadanie II c.k. w M III. Zwykle II c.k. pozostaje silnie związane z oocytem (rola midbody). Tutaj II c.k. zachowuje się jak I c.k. w normalnej mejozie. • Oocyty w 13 godzinie są w pełni zdolne do aktywacji przez plemnik, w przeciwieństwie do działania 8% etanolem. Zdolność oocytu do reakcji zależy od rodzaju bodźca aktywującego. • U myszy w oocytach pozostających w M II lub M III chromatyna tylko 1 plemnika tworzy chromosomy. • Dojrzewanie cytoplazmatyczne i jądrowe to 2 różne procesy. • Oocyty w M I mogą być aktywowane partenogenetycznie: traktowane najpierw puromycyną, potem dbcAMP

20. KONIEC