Cosa sono e cosa servono gli allergeni e gli epitopi ricombinanti nella diagnosi di allergia alimentare Dott. Alberto M

1. Cosa sono e cosa servono gli allergeni e gli epitopi ricombinanti nella diagnosi di allergia alimentare Dott. Alberto Martelli Melloni Pediatria Milano Milano 1 Febbraio 2008

3. Variabilità degli estratti per prick e RAST Estratti di fonti diverse, pur se definiti allo stesso modo possono contenere miscele di proteine qualitativamente e quantitativamente molto diverse tra loro, il che ovviamente condiziona molto l’esito dei test Grier TJ et al. Allergy Asthma Proc 2002;23:125-31. Dolen WK. Ann Allergy Asthma Immunol 1995;75:81-2.

4. Come si ottengono gli allergeni? L’estrazione e la purificazione Gli allergeni possono essere proteine solubili e glicoproteine. Le strategie utilizzate per la loro purificazione sono le stesse di quelle adottate per la purificazione delle proteine in generale. Il primo passo consiste nell'estrarre dal materiale grezzo la massima quantità di allergene, con la minima degradazione o denaturazione possibile. Scheurer S. Clin Exp Allergy 2006;36:1483-6.

5. Tecniche per identificazione dell’allergene • L'identificazione e la caratterizzazione degli allergeni avviene per mezzo di tecniche immunochimiche, biochimiche e di biologia molecolare. I metodi più comunemente usati sono: • - la immunoelettroforesi migrazione elettroforetica con Ab specifici • - la SDS - PAGE (sodium dodecyl sulphate - polyacrylamide gel electrophoresis): peso molecolare • l'isoelettrofocalizzazione (IEF), in associazione con tecniche di immunoblotting: punto isoelettrico (è il valore di pH al quale una molecola non reca alcuna carica elettrica netta). • Per alcune limitazioni di queste tecniche, spesso si rende necessario l'impiego contemporaneo di più metodi per poter giungere a risultati definitivi.

6. SDS page

7. Isoelettrofocalizzazione

8. Libraries di un DNA complementare Il principio della clonazione molecolare è basato sulla preparazione o l'isolamento del DNA che codifica il polipeptide rilevante per inserirlo in un plasmide o in un vettore batteriofagico, che può essere successivamente utilizzato per infettare un microrganismo come l'Escherichia coli. Il plasmide o il batteriofago si moltiplicano all'interno dell'Escherichia coli producendo colonie trasformate (nel caso del plasmide) o placche (nel caso del batteriofago). Braren I, et al. Clin Chem 2007;53:837-44.

9. 284 aminoacidi del Pen a 1 Reese G, et al. Clin Exp Allergy 2006;36:517-24.

11. Analisi spettroscopica Reese G, et al. Clin Exp Allergy 2006;36:517-24.

12. Cos’ è un epitopo? L’epitopo, o determinante, é la componente strutturale dell’allergene responsabile dell’interazione specifica con l’anticorpo IgE.

13. Gli epitopi lineari e conformazionali Sampson HA. J Allergy Clin Immunol 2004;113:805-19.

14. Siero albumina bovina

15. Epitopi della siero albumina bovina Restani P. Allergy 2004;59 Suppl 78:21-4

16. Come possiamo utilizzare queste informazioni nella diagnostica ? Diagnosi primaria di allergia alimentare Precoce predizione della persistenza dell’allergia alimentare Predizione di reazione severa al Tpo Determinazione delle cross-reattività

17. La tecnica dei microarray Harwanegg C. et al. Clin Exp Allergy 2003;33:7-13.

18. Diagnosi di sensibilizzazione Hiller R, et al. FASEB J. 2002;16:414-6.

19. Allergia alla carota • r Dau c 1.0104, r Dau c 1.0201 e r Dau c 4 erano clonati attraverso E. Coli. • Erano valutati i sieri di 40 pazienti allergici alla carota con challenge positivo • 98% dei pazienti allergici alla carota erano positivi ad almeno un ricombinante 98 % rDau c 1.0104 65% rDau c 1.0201 38% to rDau c 4 Ballmer-Weber BK. Clin Exp Allergy 2005; 35:970–8

21. I test con l’allergene naturale purificato Allergeni testati Performance del test The physician’s viewpoint The patient’s viewpoint The study Test outcome interpretation Sen (%;CI) Spe (%;CI) PPV (%) NPV (%) LR+ (P) LR- (P) Pre-test odds (P) Post-test odds (P) P(T+) P(T-) CM SPT 97.91 (92.60-103.22) 76.00 (60.44-91.55) 79.66 97.43 4.07 0.02 0.96 3.91 0.79 0.02 sp IgE Ab 100 (100-100) 80 (65.42-94.57) 82.75 100 5 0 0.96 4.8 0.82 0 nBos d4 62.5 (44.49-80.50) 86 (73.35-98.64) 81.08 70.49 4.46 0.43 0.96 4.28 0.81 0.29 nBos d5 62.50 (33.50-70.65) 86 (85.34-102.65) 81.81 70.49 4.46 0.43 0.96 4.28 0.81 0.29 nBos d8 58.33 (40-76.66) 88 (76.16-99.83) 89.28 67.14 8.68 0.50 0.96 8.33 0.89 0.32 Fiocchi A. data on file

22. Precoce predizione della persistenza dell’allergia alimentare Sampson HA. J Allergy Clin Immunol 2004;113:805-19.

23. Ovomucoide ed epitopi lineari • Ovomucoide è una proteina glicosilata composta da 186 aminoacidi (Gal d 1.1, 1.2 e 1.3). • I 3 domini dell’ovomucoide erano isolati e valutati con sieri di pazienti allergici all’uovo. • Una protratta allergia all’uovo è associata alla presenza di significative quantità di IgE anti epitopi lineari (sequenziali) mentre le forme a rapida tolleranza erano associate ad IgE verso epitopi conformazionali. Cooke SK, et al. J Immunol 1997;159:2026-32.

24. Più lunga tolleranza all’uovo se IgE per lineari • 2/3 degli allergici all’uovo sono tolleranti nei primi 5 anni di vita • Si è valutato il legame delle IgE di bambini con allergia all’uovo, transitoria o persistente, rispetto agli epitopi conformazionali o sequenziali (lineari) di ovomucoide, ovoalbumina, ovotransferrina. • I bambini con protratta allergia all’uovo presentano IgE elevate contro epitopi sequenziali dell’ovomucoide e dell’ovoalbumina (P < 0.01). • La presenza sierica di IgE diretti contro epitopi lineari dell’ovomucoide dovrebbero essere usati come strumento per identificare i casi a più lenta risoluzione. Järvinen KM, et al. Allergy 2007;62:758-65.

25. IgE contro epitopi lineari dell’ovomucoide Järvinen KM, et al. Allergy 2007;62:758-65.

26. Le IgE leganti peptidi per il latte vaccino Beyer K, et al. J Allergy Clin Immunol 2005;116:704-5.

27. Cosa accade per i singoli peptidi? Beyer K, et al. J Allergy Clin Immunol 2005;116:704-5.

29. Predizione di reazione severa al Tpo MAL D 1= difensina (termolabile) MAL D 2 = poco importante allergologicamente MAL D 3 = Lipid Transfer Protein (termostabile) MAL D 4 = bet v2= può dare SOA

30. La peluria della pesca è ricca di LTP • Allergia a LTP comune nell’area mediterranea ma assente nei Paesi nordici. • Le pesche sono il principale agente sensibilizzante a LTP • Gli allergici a LTP della pesca spesso tollerano altre Rosacee e sono cuti e RAST negativi alle loro LTP • La peluria della pesca contiene elevate quantità di LTP che esiste anche nella buccia • La peluria della pesca induce la sensibilizzazione a LTP • La peluria viene eliminata durante il trattamento della pesca mediterranea prima di andare a mercati lontani • La rimozione sistematica della peluria diminuisce l’allergenicità della pesca. Asero R, et al. Allerg Immunol (Paris). 2006;38:118-21.

31. Predizione della cross-reattività: le definizioni Cross-sensibilizzazione: presenza di IgE che reagiscono con proteine di origine differente portatrici di epitopi simili od identici Cross-reattività: reazione clinica ad agenti diversi, alimentari e/o inalanti, dovuta a cross-sensibilizzazione. Brusic V. et al. Allergy 2003;58:1083–1092

32. Frequenza di BA in CMA CMA 100% BA 13-20% Martelli A. et al. Ann Allergy Asthma Immunol 2002;89(6 Suppl 1):38-43.

33. La monosensibilizzazione é rara Beyer K. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2003;3:189-97.

34. Probabilità di reazione ad alimenti cross reattivi Sicherer SH. J Allergy Clin Immunol 2001;108:881-90

37. I limiti del test… • Non è stata ancora segnalata la sensibilità e la specificità del test per singola molecola allergenica. • Pochissimi lavori che esprimano la riproducibilità del test. • A seconda della fase solida che lega l’allergene risultati possono essere differenti • Difficile predizione della reazione clinica • Pertanto impossibile per ora collocarlo nell’iter diagnostico

38. A cosa servono?

39. Cosa speriamo di aspettarci • Una specifica identificazione delle molecole allergeniche per il bambino allergico • La riscrittura della storia naturale di alcune allergie alimentari in base alle molecole allergeniche coinvolte. • Lo studio di sottogruppi, per le singole allergie alimentari, che potrebbero avere corrispondenza al test di provocazione orale • La possibilità di utilizzare un vaccino sub-linguale specifico per desensibilizzare il bambino (esperienza in Spagna dell’LTP nello studio EXPO) • Informazioni ulteriori per le cross-reattività • Sapere se c’è corrispondenza fra tipo di patologia allergica espressa e la presenza di reattività a particolari molecole allergeniche.

40. Sarà così lo scenario futuro? Harwanegg C. et al. Clin Exp Allergy 2003;33:7-13.

41. Conclusioni • Il test permette di acquisire informazioni sempre più complete e dettagliate, ma anche di sempre piùdifficile interpretazione. • Tali esami devono essere considerati come test di 3° livello, da effettuarsi per approfondire la diagnostica di particolarisottogruppidi bambini già sottoposti ai test classici. • Molta strada va percorsa per conoscere vantaggi e limiti delle nuove tecnologie, definirne uso ed abuso, e arrivare infine a tracciare adeguate linee-guidaper il loro impiego clinico.