slide1 l.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
FML 13-12-04 PowerPoint Presentation
Download Presentation
FML 13-12-04

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 37

FML 13-12-04 - PowerPoint PPT Presentation


  • 151 Views
  • Uploaded on

PCR Quantitative. F Martin-Laurent et D Bru UMR Microbiologie et Géochimie des Sols, INRA/Université de Bourgogne, 17 Rue Sully, BP 86510, 21065 DIJON CEDEX, Email fmartin@dijon.inra.fr et david.bru@dijon.inra.fr. FML 13-12-04. Démonstration de PCR quantitative.

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'FML 13-12-04' - albert


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
slide1

PCR Quantitative

F Martin-Laurent et D Bru

UMR Microbiologie et Géochimie des Sols, INRA/Université de Bourgogne, 17 Rue Sully, BP 86510, 21065 DIJON CEDEX, Email fmartin@dijon.inra.fr et david.bru@dijon.inra.fr

FML 13-12-04

slide2

Démonstration de PCR quantitative

  • Principe de la PCR quantitative (F Martin-Laurent)
  • Exemple d’applications de la PCR quantitative (F Martin-Laurent)
  • Démonstration de l’utilisation du logiciel SDS (F Martin-Laurent)
  • Démonstration de l’utilisation de l’ABI7900 (D Bru
slide3

Amorces, ADN, dNTPs, Taq Pol

Dénaturation du double brin d’ADN et hybridation des amorces

95°C

72°C

Elongation

72°C

55°C

x 35 cycles

Séparation électrophorétique

Principe de la PCR conventionnelle

FML 13-12-04

slide4

Analyse en point final sur gel d’agarose

  • Analyse dynamique de la PCR quantitative
  • haute précision pendant la phase exponentielle
  • variabilité importante à la phase plateau

Phase exponentielle

Phase linéaire

Phase plateau

PCR conventionnelle versus PCR quantitative

FML 13-12-04

slide5

FAM, VIC

TAMRA

Quencher

Reporter

FP

3’

5’

3’

5’

RP

PCR quantitative avec une sonde TaqMan®

Cette méthode repose sur deux principes :

-la technologie FRET (fluorescence resonance energy transfer)

-l’activité 5’-exonucléase de la Taq Pol

-Spécificité l’amorce pour la PCR

-Spécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan

FML 13-12-04

slide6

Fluorescence

FP

Q

R

3’

5’

3’

5’

RP

Essais 5’ nucléase avec la sonde TaqMan®

-FRET (fluorescence resonance energy transfer) depuis le reporteur (haute énergie) vers le quencher (faible énergie),

pas de signal fluorescent émis par le reporteur quand la sonde est intacte

FML 13-12-04

slide7

FP

Q

3’

5’

-au cours de l’élongation catalysée par la Taq Pol l’activité 5’ nucléase déplace la sonde

R

3’

5’

RP

R

Q

FP

3’

5’

3’

5’

RP

-lorsque la polymérisation est complétée, pour chaque molécule d’ADN synthétisée un reporteur émet de la fluorescence.

Essais 5’ nucléase avec la sonde TaqMan®

FML 13-12-04

slide8

Excitation

-Le spectre d’emission du Reporteur recouvre le spectre d’absorption du Quencher

FAM

Absorbtion

Fluorescence

nm

475

550

FRET

Absorbtion

TAMRA

Fluorescence

Émission

nm

550

600

Mécanisme de quenching

-FRET

FML 13-12-04

slide9

R

NFQ

MGB

TaqMan® MGB probes

  • NFQ non fluorescent quencher
  • Nouvelle innovation

MGB minor groove binder

stabilise les 5 à 6 dernières bases de la sonde (à son extrémité 3’)

sonde plus courte et plus spécifique (pour un Tm donné)

FML 13-12-04

slide10

Mesure de fluorescence en fin d’élongation

PCR quantitative SYBR ®Green

FML 13-12-04

slide11

TaqMan ®

SYBR ® Green

TaqMan ® versus SYBR ® Green

Spécificité

-fixation des amorces,

-hybridation de la sonde,

-conditions PCR

-fixation des amorces,

-

-conditions PCR

Flexibilité

-multiplexe,

-détection de SNP,

-

-

-

-utilisation d’amorces dégénérées

Optimisation

-standardisée

-dépend du gène ciblé

-vérifier la formation de dimère d’amorces

FML 13-12-04

slide12

Echantillon 1

Echantillon 2

FAM

Rn

FAM

ROX

Fluorescence

Fluorescence

Rn

ROX

Rn= Reporter / Passive référence

ROX™ comme référence passive

Le marqueur fluorescent ROX ™ permet de normalisé les variations de fluorescence non reliées à la PCR (fluorescence des plaques ou tubes, contamination du bloc PCR,…)

FML 13-12-04

slide13

4

3

Rn

2

Ct

1

Bruit de fond

2O

3O

4O

5O

10

La valeur de Ct est déterminée dans la phase exponentielle, à l’intersection de la ligne de bruit de fond avec la courbe de fluorescence

cycle

Ligne de base

Détermination du Ct (cycle seuil)

FML 13-12-04

slide14

Courbe de calibration : comparer les valeurs de Ct

Nombre de copies (log)

Fluorescence émise (UA)

Ct

Log N = -0,26 Ct + 10,85

R2= 0,998

106

105

104

103

102

101

Cycle seuil - Ct

Nombre de cycles

Le nombre de cycles nécessaires pour atteindre une fluorescence donnée

(phase log-linéaire) est fonction du nombre d’ADN cibles initialement présents

FML 13-12-04

slide15

Quantification absolue

Log N = -0,26 Ct + 10,85

R2= 0,998

Nombre de copies (log)

Fluorescence émise (UA)

Ct

106

105

104

103

102

101

Cycle seuil - Ct

Nombre de cycles

Résultat : l’échantillon d’ADN (ex: 25 ng) contient 10000 copies du gène cible

FML 13-12-04

slide16

Efficacité de la PCR quantitative

Log N = -0,26Ct + 10,85

R2= 0,998

Nombre de copies (log)

Efficacité = 10(-pente) -1

atzA

Cycle seuil - Ct

Si la pente est égale à 0.301 alors l’efficacité de la PCR quantitative est de 100 %

Exemple

pente = -0.26

E = 10(0.26) –1

= 1.82 – 1

= 0.82 soit 82 %

FML 13-12-04

slide17

PCR efficace à 100%

y = x (1 + E)n

Quand E = 1 alors :

Ct = + 1  augmentation x2

Ct= + 3.32  augmentation x10

cas spécifique E = 1 alors

y = x 2n

y=nombre de copie du gène cible

x=nombre de copie initiale

E=efficacité

n=nombre de cycle PCR

FML 13-12-04

slide18

Quantification relative

  • pas besoin de courbe de standard
  • calcul des résultats pas comparaisons des Ct
  • nécessité de définir :
    • un gène cible servant de contrôle endogène,
    • un gène cible servant de standard.
  • le contrôle endogène :

- donne une image de la quantité de matrice apportée (ADN ou ADNc),

- est présent en quantité constante dans tous les échantillons,

- normalise :

- les biais d’extraction et de contaminations par des inhibiteurs (ADN)

- les variations d’éfficacité de transcription inverse

FML 13-12-04

slide19

Standard

t=2

t=4

t=7

t=14

t=21

t=0

-t0 ajout d’atrazine à des mésocosmes de sol,

-t0 sera utilisé comme valeur standard

FML 13-12-04

slide20

Rn

Contrôle endogène

Contrôle endogène

Rn

Gène cible

Gène cible

Ct = 22 – 16 = 6

Ct = 21 – 15 = 6

Ct=16

Ct=22

Cycle

Ct=16

Ct=22

Cycle

Ct=15

Ct=21

Comparaison du gène cible avec le contrôle endogène

Si 2 x plus de matrice ?

FML 13-12-04

slide21

t2

t0

Rn

Rn

Ct=16

Ct=16

Ct=26

Cycle

Ct=32

Cycle

t4

t7

Rn

Rn

Ct=12

Ct=15

Ct=22

Cycle

Ct=31

Cycle

Contrôle endogène

Gène cible

Comparaison de Ct

FML 13-12-04

slide22

Comparaison de Ct

Etape 1: normalisation par rapport au contrôle endogène

Ct gène cible – Ct contrôle endogène = Ct

Etape 2: normalisation par rapport au standard

Ct échantillon - Ct standard = Ct

Etape 3: détermination de la variation du nombre de copie du gène cible

2-Ct

FML 13-12-04

slide23

Quantification relative des résultats

t0

t2

64

64

t4

Augmentation par x

t7

1

1

standard

FML 13-12-04

slide24

Exercice (1/4)

Contrôle

16S rRNA Ct 14

atzA Ct 32

Atrazine

16S rRNA Ct 16

atzA Ct29

Quel échantillon d’ADN est le plus concentré et de combien de fois ?

16S rRNA étant utilisé comme contrôle endogène….

FML 13-12-04

slide25

Exercice (2/4)

Contrôle

16S rRNA Ct 14

atzA Ct 32

Atrazine

16S rRNA Ct 16

atzA Ct29

Ct 16SrRNA = 16 –14 = 2

2Ct 16SrRNA = 22 = 4

La concentration d’ADN de l’échantillon contrôle est 4 x plus élevée que celle de l’échantillon atrazine.

FML 13-12-04

slide26

Exercice (3/4)

Contrôle

16S rRNA Ct 14

atzA Ct 32

Atrazine

16S rRNA Ct 16

atzA Ct29

Quel échantillon d’ADN contient le plus grand nombre de copie de la séquence atzA ?

FML 13-12-04

slide27

Exercice (4/4)

Contrôle

16S rRNA Ct 14

atzA Ct 32

Atrazine

16S rRNA Ct 16

atzA Ct29

Ct contrôle= 32 – 14 = 18

Ct atrazine= 29 – 16 = 13

Ct = 18 – 13 = 5

2Ct = 25 = 32

Le nombre de copie du gène atzA est 32 fois plus élevé dans l’échantillon de sol traité avec l’atrazine que dans le contrôle

FML 13-12-04

slide28

Analyse de la structure des communautés microbiennes

Amplification PCR

Amorces universelles : 38f et 72r

IGS

5’

A

16 S

23 S

3’

RISA :

Ribosomal Intergenic Spacer Analysis

IGS

5’

B

16 S

23 S

3’

MM

MM

MM

MM

12 14 15 16 17 18 20 21 22 25 26 44 45 46 47 48 49 50

kpb

• Profils de bandes complexes

• numérisation du gel et analyse statistique (présence/absence, intensité des bandes)

1.114

0.900

0.404

0.242

0.190

0.147

0.124

FML 13-12-04

slide29

FM

SS100

U

SS10

L

IA

900

692

501

484

404

320

LP

FP

HP

LDCSS-

HAP

U

LDSS

LDCSS

Analyse des communautés microbiennes du sol de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule.

Couhins

Pierrelaye

La Bouzule

U : contrôle

LDSS : boue deshydratée

LDCSS : boue deshydratée compostée

LDCSS+HAP : boue deshydratée compostée amendée avec des HAP

U : contrôle

FM : fumier 10t/h/an

SS10 : boue 10t/h/an

SS100 : boue 100t/h/an

LP : pollution faible

FP : pollution moyenne

HP : pollution élevée

FML 13-12-04

slide30

0.25

0.16

0.16

-0.25

0.15

-0.16

0.35

-0.16

0.16

PC2 20%

-0.2

-0.15

PC2 21%

-0.15

SS10

LDSS

LP

FM

PC1 45.3%

U

SS100

PC1 30%

HP

LDCSS

PC1 30%

LDCSS-HAP

U

PC2 15.2%

FP

La Bouzule

Couhins

Pierrelaye

Analyse des communautés microbiennes du sol de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule.

U : contrôle

LDSS : boue deshydratée

LDCSS : boue deshydratée compostée

LDCSS+HAP : boue deshydratée compostée amendée avec des HAP

U : contrôle

FM : fumier 10t/h/an

SS10 : boue 10t/h/an

SS100 : boue 100t/h/an

LP : pollution faible

FP : pollution moyenne

HP : pollution élevée

FML 13-12-04

slide31

Cinétique de minéralisation de l ’atrazine des sols de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule.

Couhins

Pierrelaye

La Bouzule

FML 13-12-04

slide32

a

a

b

a

b

b

b

b

b

Potentiel génétique de minéralisation de l ’atrazine des sols de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule.

a

a

ab

a

ab

a

ab

ab

a

a

b

b

b

b

b

ab

b

ab

a

a

a

a

a

a

FML 13-12-04

slide33

PRINCIPE DE LA RT-qPCR

1 ARNm = 1 ADNc

1. Transcription inverse d’ARNm cibles en ADNc

2. Quantification des ADNc par PCR quantitative en temps réel - qPCR

Nombre de copies (log)

Fluorescence émise (UA)

Ct

Log N = -0,26 Ct + 10,85

R2= 0,998

106

105

104

103

102

101

Cycle seuil - Ct

Nombre de cycles

Le nombre de cycles nécessaires pour atteindre une fluorescence donnée

(phase log-linéaire) est fonction du nombre d’ADN cibles initialement présents

FML 13-12-04

slide34

OH

Cl

N

N

N

N

atzC

NHCH2CH3

OH

(CH3)2CH2HN

HO

N

N

Acide cyanurique

atrazine

atzA

OH

N

N

(CH3)2CH2HN

NHCH2CH3

N

Hydroxyatrazine

atzB

OH

N

N

OH

(CH3)2CH2HN

N

N-isopropylammélide

VOIE DE MINÉRALISATION DE L’ATRAZINE

atzD

H2N

NH2

O

O

N

H

Biuret

atzE

-

H2N

O

O

O

N

H

Allophanate

atzF

CO2 + NH4+

FML 13-12-04

slide35

Niveau d’expression de l’ADNr 16S

ARNr 16S / ng d’ARN extrait

Temps (min)

Temps (min)

la quantité d’ARNr 16S est stable pendant l’expérience

L’ARNr 16S = référence interne pour la mesure de l’expression des gènes atz au cours du temps

FML 13-12-04

slide36

Niveau d’expression des gènes atzA, B et C

P.ADP

C. heintzii

atzA

atzA

  • P.ADP
  • - ATRAZINE :
  • Expression basale des gènes atz
  • + ATRAZINE :
  • Augmentation transitoire de l’expression des gènes atz

ARNm /106ARNr 16S

ARNm /106ARNr 16S

Temps (min)

Temps (min)

atzB

atzB

  • C. heintzii
  • - ATRAZINE :
  • seul atzA s’exprime
  • + ATRAZINE :
  • Augmentation de l’expression des gènes atzA et B
  • Pas d’expression d’atzC

ARNm /106ARNr 16S

ARNm /106ARNr 16S

Temps (min)

Temps (min)

atzC

atzC

ARNm /106ARNr 16S

ARNm /106ARNr 16S

Temps (min)

Temps (min)

L’EXPRESSION DES GÈNES ATZ EST FONCTION DE LA SOUCHE BACTÉRIENNE CONSIDÉRÉE

FML 13-12-04

slide37

Niveau d’expression des gènes atzD, E et F

atzD

2 000

a

1 500

a

x 150

ab

1 000

a

Relative number of mRNA

a

500

ab

a

b

b

b

b

b

0

0

100

200

300

400

Time (min)

atzE

160

a

140

120

100

80

60

Relative number of mRNA

x 20

a

a

a

40

b

ab

20

b

ab

b

b

0

0

100

200

300

400

Time (min)

atzF

400

350

300

Temps (min)

250

200

150

Relative number of mRNA

100

50

0

0

100

200

300

400

Time (min)

En absence d’atrazine, atzD, E et F s’expriment de façon basale

L’expression d’atzD et atzE augmentent300 min après l’ajout d’atrazine

L’expression d’atzF n’est pas affectée par l’ajout d’atrazine

Augmentation de l’expression des gènes de l’opéron atzDEF selon un gradient

FML 13-12-04