slide1 n.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
Autoassemblage de macromolécules biologiques via des poly(pyrroles) et/ou des PowerPoint Presentation
Download Presentation
Autoassemblage de macromolécules biologiques via des poly(pyrroles) et/ou des

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 39
acton-sparks

Autoassemblage de macromolécules biologiques via des poly(pyrroles) et/ou des - PowerPoint PPT Presentation

83 Views
Download Presentation
Autoassemblage de macromolécules biologiques via des poly(pyrroles) et/ou des
An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript

  1. Autoassemblage de macromolécules biologiques via des poly(pyrroles) et/ou des nanotubes de carbone fonctionnalisés. Thèse de doctorat Jessica BAUR

  2. Sommaire Introduction Le poly(pyrrole-NTA) : une plateforme polyvalente pour l’immobilisation de biomolécules Les nanotubes de carbone et leur incorporation dans les architectures biomoléculaires Conclusions et perspectives Remerciements 1

  3. Récepteur biologique SIGNAL Film Transducteur Analytes Electrochimique Gravimétrique Oligo-sonde / oligo-cible Anticorps / antigène Substrat / enzyme … Optique Thermique… Introduction générale Les biocapteurs • Applications : sciences de la vie (agroalimentaire, médecine…), environnement (pollution), bioterrorisme • Etape déterminante : immobilisation du biorécepteur sur le transducteur • → poly(pyrroles) électrogénérés = versatilité, stabilité, conduction, adressage électrochimique • Challenges : augmenter les performances (sensibilité, spécificité, stabilité…) et diminuer la taille • → architectures tridimensionnelles à base de nanotubes de carbone 2

  4. S S S S S S S S P P P P P P P P S P S P S P S P adsorption greffage chimique électropolymérisation Introduction générale Les polymères électrogénérés 3

  5. ancrage par interactions affines S P S P S S S S P P P P S P encapsulation Introduction générale Les polymères électrogénérés systèmes affins les + utilisés : avidine/biotine adamantane/b-cyclodextrine NTA/Cu2+/histidine 4

  6. Single-Walled Carbon Nanotubes SWCNTs Multi-Walled Carbon Nanotubes MWCNTs 200 nm 200 nm Introduction générale Les nanotubes de carbone (CNTs) : présentation • → Structure : feuillet de graphène enroulé « sans couture ». • → Les deux types de CNTs : 5

  7. Introduction générale Les nanotubes de carbone (CNTs) : présentation • → Propriétés : • Conductivités thermique et électrique, résistance mécanique, légèreté. • avantage pour les biocapteurs ou les biopiles : haute surface spécifique (1000 m2.g-1) • → Inconvénients : • purification difficile et/ou coûteuse (carbone amorphe, graphite, particules de catalyseur…) • solubilisation : mise au point d’un pré-traitement[1] sans prétraitement, SWCNTs dans le THF avec prétraitement, SWCNTs dans le THF 6 [1] R. Haddad et al. Analyst 2009, 134, 2412-2418.

  8. Introduction générale Les nanotubes de carbone (CNTs) : fonctionnalisation • → Quelques méthodes : CNTs Fonctionnalisation non-covalente Fonctionnalisation des défauts électropolymérisation Fonctionnalisation covalente • → Techniques utilisées : • - fonctionnalisation non-covalente par p-stacking pour l’immobilisation de la GOX • - combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour l’encapsulation d’une hydrogénase NiFe 7

  9. Sommaire Introduction Le poly(pyrrole-NTA) : une plateforme polyvalente pour l’immobilisation de biomolécules • Présentation du poly(pyrrole-NTA) et généralités • Elaboration d’un capteur à ADN pour la détection du VIH • Mise en évidence d’une nouvelle interaction Les nanotubes de carbone et leur incorporation dans les architectures biomoléculaires Conclusions et perspectives Remerciements 8

  10. Le pyrrole-NTA : généralités → Structure[2] acide nitrilotriacétique = NTA → L’interaction NTA/Cu2+/histidine Biomolécules marquées avec des histidines immobilisées : → l’ADN du VIH capteur à ADN pour la détection du VIH → la glucose oxydase (enzyme modèle) biocapteur enzymatique pour la détection du glucose 9 [2] N. Haddour et al. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 5752-5753.

  11. Formation du (poly)pyrrole : → augmentation du signal électroactif réversible du poly(pyrrole) Signal irréversible du motif pyrrole → Etapes pour l’immobilisation de biomolécules histidinylées GOX → polymérisation du pyrrole-NTA → incubation avec Cu2+ (10-2 mol.L-1, 20 min) → incubation avec biomolécule marquée avec des histidines (0,5 mg.mL-1 ; 30 min) GOX électrode Le pyrrole-NTA : généralités → Etude électrochimique [pyrrole-NTA] = 5.10-3 mol.L-1, CH3CN + LiClO4 (0,1 mol.L-1), électrode Pt (Ø = 5 mm), v = 100 mV.s-1 10

  12. FITC électrode électrode électrode électrode Elaboration d’un capteur à ADN pour la détection du VIH → Caractérisation qualitative de l’interaction NTA/Cu2+/His-ADNsonde clichés de microscopie à fluorescence obtenus après incubation avec avidine-FITC et rinçage, capteur à ADN complet électrode recouverte de Ppyr-NTA après ancrage de His-ADNsonde sur le Ppyr-NTA électrode nue séquence His-ADNsonde : 5′-NH2-(His)5-GAGACCATCAATGAGGAAGCTG-3′ 11

  13. Equation de Sauerbrey : Elaboration d’un capteur à ADN pour la détection du VIH → Caractérisation quantitative de l’interaction NTA/Cu2+/His-ADNsonde/ADNcible microbalance à quartz (QCM), quartz d’or modifiés par le poly(pyrrole-NTA)/Cu2+. recouvrement surface avec His-ADNsonde : 94 % pourcentage d’hybridation : 45 % angle surface-duplex d’ADN : 80 ° (a) His-ADNsonde, (b) B-ADNcible et (c) avidine solutions dans le PBS (0,05 mol.L-1, pH = 7, NaCl 0,5 mol.L-1) ; débit : 50 µL.min-1 (a) : 0,01 mg.mL-1, (b) : 0,01 mg.mL-1 et (c) : 0,5 mg.mL-1 12

  14. I 2 DI Ic 2 DE E Ec résistance trop importante : utiliser une sonde neutre représentation utilisée : plan complexe de Nyquist Circuit électrique équivalent modèle choix de la sonde électrochimique : 1) Fe(CN)63/4-(4.10-3 mol.L-1), Eapp = OCP / ECS et DE = 5 mV rms. W RTC Rel ZW d CDC - Im(Z) (W) f° Rel RTC Rd Re(Z) (W) 2) hydroquinone (10-3 mol.L-1), Eapp = 0,4 V / ECS et DE = 5 mV rms. Elaboration d’un capteur à ADN pour la détection du VIH → Etude du capteur à ADN par spectroscopie d’impédance électrochimique (EIS) avantages : décomposition du processus électrochimique global en processus élémentaires et cible non marquée principe de la spectroscopie d’impédance électrochimique : gamme de fréquences : 0,1 Hz à 500 kHz. 13

  15. Ppyr-NTA Ppyr-NTA Elaboration d’un capteur à ADN pour la détection du VIH → Etude du capteur à ADN par spectroscopie d’impédance électrochimique [hydroquinone] = 10-3 mol.L-1, Eapp = 0,4 V / ECS, DE = 5 mV rms, électrode CV (Ø = 3 mm) et gamme de fréquences : 0,1 Hz à 500 kHz. Ancrage de His-ADNsonde sur le Ppyr-NTA : Détection du phénomène d’hybridation de l’ADN : demi-cercle → RTC DRTC plus importante avec l’ADN complémentaire Solutions contenant 10-8 mol.L-1 d’ADN complémentaire ou non-complémentaire 14 J. Baur et al. Anal. Chem. 2010, 82, 1066-1072.

  16. Elaboration d’un capteur à ADN pour la détection du VIH → Etude du capteur à ADN par spectroscopie d’impédance électrochimique détermination de la limite de détection du capteur à ADN [hydroquinone] = 10-3 mol.L-1, Eapp = 0,4 V / ECS, DE = 5 mV rms, électrode CV (Ø = 3 mm) et gamme de fréquences : 0,1 Hz à 500 kHz. DRTC augmente avec [ADNcible] [ADNcible] croissantes entre (a) 10-17 et (f) 3,1.10-6 mol.L-1 courbe d’étalonnage : DRTC = f([ADNcible]). gamme de linéarité : 10-15 à 10-8 mol.L-1 pente = 89,8 W.unité log-1 limite de détection : 10-15 mol.L-1 15 J. Baur et al. Anal. Chem. 2010, 82, 1066-1072.

  17. Elaboration d’un capteur à ADN pour la détection du VIH → Etude du capteur à ADN par conductimétrie courbe d’étalonnage pour f = 3 Hz [hydroquinone] = 10-3 mol.L-1, Eapp = 0,4 V / ECS, DE = 5 mV rms, électrode CV (Ø = 3 mm) et gamme de fréquences : 0,1 Hz à 500 kHz. DZ3Hz augmente avec [ADNcible] courbe d’étalonnage : DZ3Hz = f([ADNcible]). gamme de linéarité : 10-15 à 10-8 mol.L-1 pente = 82,8 W.unité log-1 limite de détection : 10-15 mol.L-1 16 J. Baur et al. Anal. Chem. 2010, 82, 1066-1072.

  18. Démonstration qualitative de cette nouvelle interaction par microscopie à fluorescence : cliché obtenus après incubations avec GOX-B et l’avidine-FITC puis rinçage, Rappel : pas d’ancrage de l’avidine-FITC sur les électrodes ni sur le Ppyr-NTA/Cu2+ FITC NTA/Cu2+/(histidine)2 NTA/Cu2+/(biotine)2 électrode GOX • interaction entre l’atome S de la biotine • et l’ion Cu2+ démontrée en 1970[2] [2] R. Griesser et al. Biochemistry 1970, 9, 3285-3293. Mise en évidence d’une nouvelle interaction entre NTA/Cu2+ et la molécule biotine • → Interaction NTA/Cu2+/histidine performante pour l’immobilisation de l’ADN • → Soupçons d’interaction entre le polymère et la biotine 17

  19. Ppyr-NTA Mise en évidence d’une nouvelle interaction NTA/Cu2+/biotine • → Etude de l’ancrage de l’ADN par spectroscopie d’impédance électrochimique : Ancrage de B-ADNsonde sur le Ppyr-NTA : Phénomènes d’ancrage et d’hybridation confirmés Comparaison des deux systèmes délicate (interaction et ADN différents) Utilisation d’enzyme (GOX) pour comparaison Détection du phénomène d’hybridation de l’ADN : [hydroquinone] = 10-3 mol.L-1, Eapp = 0,4 V / ECS, DE = 5 mV rms, électrode CV (Ø = 3 mm) et gamme de fréquences : 0,1 Hz à 500 kHz. 18 J. Baur et al. Electrochem. Commun. 2010, 12, 1287-1290.

  20. électrode GOX GOX GOX électrode électrode Comparaison des résultats obtenus pour l’immobilisation de la glucose oxydase (enzyme modèle) Courbes typiques cinétique enzymatique : I = f([glucose]) → aux faibles [glucose] : partie linéaire initiale = sensibilité de l’électrode → aux fortes [glucose] : plateau = Jmax, saturation de l’enzyme en substrat. Eapp = 0,6 V / ECS, tampon phosphate (0,1 mol.L-1, pH = 7). 19

  21. Comparaison des résultats obtenus pour l’immobilisation de la glucose oxydase (enzyme modèle) référence Perméabilités : poly(pyrrole-NTA) : Pm = 10-1 cm.s-1 et poly(pyrrole-biotine) : Pm = 10-3 cm.s-1 (facteur 100) Performances similaires entre les systèmes NTA/Cu2+/histidine et NTA/Cu2+/biotine Meilleures performances en présence du duplex d’ADN → + d’enzymes immobilisées (ADN agit comme un éventail) 20 [3] S. Cosnier et al. Anal. Chem. 1999, 71, 3692-3697.

  22. Conclusions 1ère partie : le poly(pyrrole-NTA) • Avantages du poly(pyrrole-NTA) : • → bonne perméabilité du polymère et faible limite de détection • → possibilité d’immobiliser des molécules marquées avec des histidines OU des biotines • → adressage électrochimique propre aux polymères électrogénérés • Avantages de l’interaction NTA/Cu2+/histidine : • → réversibilité de l’interaction NTA/Cu2+/histidine • Avantages du nouveau système NTA/Cu2+/biotine : → par rapport au système NTA/Cu2+/histidine : disponibilité commerciale des molécules biotinylées → par rapport au système classique avidine/biotine : meilleures performances → alternative séduisante au système avidine/biotine 21

  23. Sommaire Introduction Le poly(pyrrole-NTA) : une plateforme polyvalente pour l’immobilisation de biomolécules Les nanotubes de carbone et leur incorporation dans les architectures biomoléculaires • Fonctionnalisation multiple de CNTs • Combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour la connexion d’une réductase Conclusions et perspectives Remerciements 22

  24. électrode électrode • → Procédure : trempage de l’électrode dans une solution contenant un ou des pyrènes fonctionnalisés 5.10-4 mol.L-1 dans le THF dépôt SWCNTs dispersés 20µL à 0,1 mg.mL-1 dans le THF séchage répétition x2 • → L’interaction CNT/pyrène : • → Synthèse de pyrènes fonctionnalisés par des partenaires affins : Fonctionnalisation multiple des CNTs pour l’immobilisation d’enzymes (GOX) 23

  25. GOX GOX GOX électrode électrode électrode Fonctionnalisation simple des SWCNTs • Système • adamantane/b-cyclodextrine • Système • NTA/Cu2+/histidine • Système • biotine/avidine/biotine solutions contenant un des 3 pyrènes (5.10-4 mol.L-1) Eapp = 0,6 V / ECS, tampon phosphate (0,1 mol.L-1, pH = 7). 24

  26. référence Comparaison des résultats obtenus pour la fonctionnalisation simple des SWCNTs Système adamantane/b-cyclodextrine le plus performant Gammes de linéarité et seuil de détection similaires entre les systèmes adamantane/b-cyclodextrine et NTA/Cu2+/histidine Plus mauvais : avidine/biotine → phénomène d’écrantage dû à l’avidine 25

  27. GOX GOX avidine b-CD-GOX Cu2+ His-GOX GOX GOX GOX GOX B-GOX Fonctionnalisation multiple des SWCNTs mélange équimolaire 1/1/1 des 3 pyrènes (5.10-4 mol.L-1) Eapp = 0,6 V / ECS, tampon phosphate (0,1 mol.L-1, pH = 7). 26

  28. Fonctionnalisation multiple des SWCNTs • → Résultats : • → Démonstration possibilité de fonctionnaliser les SWCNTs avec les 3 systèmes affins considérés (NTA/Cu2+/His, avidine/biotine, adamantane/b-CD) par simple trempage. • → Applications : détection multienzymatique à activités combinées, détection de plusieurs analytes… 27

  29. H2ase = H2ase hydrogénase H2ase H2ase H2ase = viologène électrode de carbone vitreux = CNTs H2 H2ase oxydée MV·+ électrode e- H2ase reduite 2 H+ MV2+ Combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour la connexion électrique d’une hydrogénase • → Combinaison performances CNTs et poly(pyrrole) site actif NiFe • → L’hydrogènase NiFe de Desulfovibrio fructosovorans pour la bioconversion de l’énergie : • Enzyme qui catalyse de façon réversible : • H2 = 2 H+ + 2e- • capacité double : • - transformer H2 en énergie électrique • - stocker H2 3 clusters FeS • → Mode de fonctionnement pour l’oxydation de H2 (transfert d’électrons indirect) : 28

  30. H2ase H2ase H2ase H2ase électrode viologène = MV2+ (médiateur rédox) Combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour la connexion électrique d’une hydrogénase • → Polymère choisi : le poly(pyrrole-viologène) • viologène = médiateur pour le transfert électronique entre l’enzyme et l’électrode • structure[4] : → Immobilisation par encapsulation dans le film de poly(pyrrole-viologène) sur des dépôts de CNTs : dépôt mélange H2ase + monomère dépôt SWCNTs dispersés électro- polymérisation séchage séchage électrode électrode électrode électrode dépôt CNTs : n x 10µL à 0,1 mg.mL-1 dans le THF mélange H2ase (0,2 mg.mL-1) + pyrrole-MV (4.10-3 mol.L-1) : 10 µL polymérisation : Eapp = 0,8 V / ECS, H2O + LiClO4 (0,1 mol.L-1). répétition (n fois) 29 [4] S. Cosnier et al. J. Electroanal. Chem. 1997, 433, 113-119.

  31. H2ase H2ase H2ase H2ase H2ase = H2ase hydrogénase H2ase électrode H2ase H2ase = viologène électrode = CNTs Combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour la connexion électrique d’une hydrogénase • → Etude sur électrode de carbone vitreux : Jcat = 17 µA.cm-2 électrode de carbone vitreux • → Etude sur électrodes de carbone vitreux modifiées par les CNTs : MWCNTs SWCNTs Jcat = 103 µA.cm-2 Jcat = 301 µA.cm-2 Meilleures performances avec les MWCNTs • quantités d’enzyme et de monomère constantes, dégazage Ar 30 min, H2 30 min puis activation H2ase : Eapp = - 0,8 V / ECS (15 min) dans le tampon phosphate (0,1 mol.L-1, pH = 7) et étude dans la même solution par CV et enfin Ar 15 min puis CV. 30

  32. 200 nm 200 nm 200 nm 200 nm Combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour la connexion électrique d’une hydrogénase • → Caractérisation par microscopie électronique à balayage (MEB) : SWCNTs MWCNTs avant polymérisation après polymérisation Surface « lissée » avec les SWCNTs Conservation de la porosité avec les MWCNTs ↔ meilleures performances 31

  33. Combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour la connexion électrique d’une hydrogénase • → Evolution de l’intensité catalytique en fonction de la quantité de MWCNTs : Partie linéaire courbe Jcat = f(quantité MWCNTs) linéaire entre 10 et 50 µL de MWCNTs déposés • quantités d’enzyme et de monomère constantes, seul VMWCNTs change • partie anodique des courbes de voltampérométrie cyclique Probablement dû à : augmentation de la surface spécifique des électrodes due aux MWCNTs, meilleure perméabilité, transfert d’électrons facilité du fait d’une meilleure conduction… 32

  34. Conclusions 2ème partie : les nanotubes de carbone • Fonctionnalisation multiple de SWCNTs : • → mise en œuvre simple par trempage • → possibilité de fonctionnalisation avec 3 systèmes affins différents • Combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour la connexion électrique d’une hydrogénase • → résultats préliminaires mais prometteurs • → augmentation du signal obtenu après dépôt de CNTs en général et plus particulièrement avec les MWCNTs • Nanotubes de carbone : • → augmentation de la surface spécifique des électrodes • → augmentation de la conduction et de la perméabilité des films 33

  35. PERSPECTIVES • Poly(pyrrole-NTA) : NTA/Cu2+/biotine • → réversibilité, • → utiliser dans des biocapteurs (Ab/Ag, ADN…), • → taux de recouvrement de surface. • CNTs : • → architecture multifonctionnelle : applications diverses, • → connexion d’une hydrogénase NiFe : optimisation du système. CONCLUSIONS GENERALES • Potentiel des films de poly(pyrrole) et des nanotubes de carbone pour : • → augmenter sensibilité et seuil de détection des architectures biomoléculaires • → immobilisation de biomolécules en général • → réaliser systèmes multifonctionnels • → combinaison des deux : amplification des performances 34

  36. Remerciements Jury : Rapporteurs : Dr. Elisabeth Lojou et Pr. Alexander Kuhn Examinateurs : Dr. Gérard Bidan et Pr. Pierre Gros Département de Chimie Moléculaire Equipe BEA : Directeurs de thèse : Dr. Serge Cosnier et Dr. Michael Holzinger, Dr. Chantal Gondran, Arielle Le Pellec, Dr. Alan Le Goff, Dr. Karine Gorgy Permanents et étudiants du DCM Merci pour votre attention! 35

  37. Fonctionnalisation simple des SWCNTs

  38. Connexion d’une hydrogénase NiFe sur les MWCNTs • → Etude de l’évolution du signal de Fe(CN)64- en fonction de la quantité de MWCNTs : Courbe I(Fe(CN)64-) = f(quantité MWCNTs) linéaire entre 10 et 60 µL de MWCNTs déposés. Confirme l’hypothèse d’augmentation de la surface spécifique des électrodes due aux MWCNTs mais ne la valide pas : vérifier absence d’accumulation de Fe(CN)64- dans les MWCNTs.