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Controle epigenético da expressão gênica em plantas

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Controle epigenético da expressão gênica em plantas. Alteração da expressão gênica sem alterações na sequência de DNA. Caso clássico: Alterações epigenéticas que afetam propriedades de pigmentação. Duas possibilidades: permanecem após a meiose x não permanecem após a meiose.

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Presentation Transcript
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Controle epigenético da expressão gênica em plantas

Alteração da expressão gênica sem alterações na sequência de DNA

Caso clássico: Alterações epigenéticas que afetam propriedades de pigmentação

Duas possibilidades: permanecem após a meiose x não permanecem após a meiose

Mudancas epigenenéticas típicas das plantas: normalmente transmitidas na meiose

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Mecanismos da variação epigenética: Metilação do DNA

Mudanças no posicionamento do nucleossoma

Mudanças no empacotamento dos nucleossomas

Modificações covalentes do nucleossoma

Metilação: mecanismo mais connhecido

DNA-metil transferase; preferência pelo motivo CpG ou Cp

Metilação: mecanismos para garantir a heranca mitótica ou meiótica de

padrões específicos de metilação.

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1) : ATPase tipo SNF2 (Lsh) aflouxa os contatos entre o DNA e as histonas

2) Metiltransf. da histona (Suv39H1) metila Lys hist. (estrela):

Configuração da cromatina permissível à metilação

3) “Targeting factor” reconhece a sequência a ser metilada,

e traz consigo os fatores para a metilação:

DNMT1: citosina-5-metil transferase

HDAC: desacetilase da histona

MeCP2: proteína de ligação ao DNA metilado

4) Sin3a +HDAC: desacetilação das histonas

resultando em sua condensação

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Mecanismo epigenético 1: Imprinting

Imprinting: a expressão de certos alelos difere dependendo da origem do gameta

Exs: mamiferos, fungos e plantas

Ex: pigmentação da semente de milho: alelos r (red):

Bom nível de expressão quando

transmitido pelo óvulo ::cor sólida da

semente

Baixo nível de expressão quando

transmitido pelo pólem ::cor variegada:

Diferenças fenotípicas: não depende da dosagem do gene R

mas sim de mudanças epigenéticas que são macho-específicas

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Imprinting: sementes; mudanças epigenéticas relacionadas a dosagem gênica e

ligadas ao sexo

Grande desenvolvimento do endosperma

periférico e chalazal, mas sem celularização

2x x 2x

Reduzido endosperma

periférico e chalazal

Transgênicos e Mutantes

hipometilados

Fenocópia 4x x 2x

Fenocópia 2x x 4x

Fenocópia 2x x 6x

Maternalização = redução da metilação

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paternal

Fatores epigenéticos controlando o desenvolvimento da semente

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Mecanismo do imprinting (ratos)

Estimuladores

Endoderme

Mesoderma

Bloqueia o estimulador de Igf2

Específico para

mesoderme

Dois genes reciprocamente sofrendo imprinting: 90 kb distância Igf2: fator cresc. fetal H19: RNA sem prot.

DMD: differentially methylated domain -> silenciador: papel no “desliga expressão” H19 e IGF2

?

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Mecanismo epigenético 2: Paramutação

Interação alélica: a expressão de um alelo em um heterozigoto é alterada na

presenca de outro; herdável através da meiose

Alelo B(booster): B-I: pigmentacao forte; B’: pigmentacao fraca

B-I: mesmo gene: heterozigoto

transmite somente o alelo B’

B’: transcrição 10-20 vezes menor

Alelo Pl; forte pigmentação das anteras;

Pl’: cor variegada

PI e P’: mesmo gene: heterozigoto transmite somente o alelo P’

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formação da heterocromatina

enzimas modificadoras das histonas

fatores remodeladores da cromatina

Promotor 1

Promotor 2

RNA

aberrante

Transferência direta de elementos

da cromatina

DNA metilado: proteínas ligam-se ao DNA metilado

Mecanismo da paramutação;

Mecanismo 2

Mecanismo 1

Interação dos cromossomas

Sinal difusivel: RNA

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Arabidopsis: o caso dos genes PAI:

sintese triptofano:

2 genes, em 2 cromos.

Introdução de novos genes PAI não metilados tornam-se metilados

PAI: Phosphoribosilanathranilate isomerase

Citosinas metiladas podem ser mantidas na replicação

Mutantes com alterações no mecanismo epigenético da regulação gênica

Milho: mop1: mediator of paramutation 1: bloqueia a paramutação do gene B e

de outros pigmentos

ambos genes PAI tornam-se então metilados

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[]

Reação catalizada pela enzima PAI

……….

intermediário fluorescente

X

Triptofano

Única sequência PAI que

pode ser expressa no

cromossoma 1 foi mutada

metilacoes

Nivel de metilação = reostato

redução na

fluorescência

metilação

controle do nível de

expressão gênica

Estratégia de seleção de mutações que afetam as mudancas epigenéticas em PAI

Planta transgênica

utilizado na

seleção genética

10 mutante

isolado

20 mutante

isolado

Met1 e CMT3: codificam para

duas diferentes

metil-transferases deDNA

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Mecanismo epigenético 3: Silenciamento

Detecção: plantas trangênicas; Arabidopsis, Petunia e tabaco

Repetição da presença de genes :::: silenciamento de outras sequências

Estrutura ou organização do cromossoma como causa do silenciamento

Petunia mutata : sem cor (sem o gene A1):

Introdução gene A1 do milho: cópia simples:

Flor torna-se pigmentada

Adição da segunda cópia de A1: transcrição

silenciada: herdável geneticamente

Variegação:

Silenciamento da segunda cópia

Gene silenciado A1 pode induzir silenciamento epigenético de outro gene A1 novo,

somente quando esse gene A1 expresso é inserido próximo do primeiro.

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Mecanismos: TGA (transcriptional gene silencing) pela metilação

ddm1: afeta o reconhecimento da metilação

met1: afeta a metilação

mom1: TGS independente da metilação

PTGA (post-transcriptional gene silencing) pela metilação: não afeta a transcrição

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Mecanismo epigenético 3: Silenciamento: Co-supressão

Silenciamento de outro vírus:

Transmissão do sinal por toda a

planta:

Efeito a nível pós-transcripcional

Transgene pode induzir o silenciamento de um gene endógeno e homólogo

Silenciamento não-herdável

Experiência da sobre-expressão da chalcone sintase

Co-supressão não herdável geneticamente: atividade

endógena é restabelecida quando ocorre a segregação do transgene

Silenciamento de viróides: enxerto

de planta contaminada por um vírus

em outra planta contaminada com

outro vírus:.

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Híbrido

F1

podem romper o pareamento e distribuição

Duplicação

gênica

: duplicação dos cromossomas

Duplicação

gênica

- silenciamento genes duplicados;

- reduzir “infidelidade” cromossomal

Alopoliplóide

Eventos epigenéticos na poliploidização

(70% angiosperma; 95% pteridófitas)

Diferencas no número de cormossomas

ou organização

Inicio da formação de um poliplóide: “choque”:

Autopoliploide

Autopoliploidia; oportunidade para alterar a expressão gênica (silenciamento), e criar um tampão contra o efeito de mutações deletérias

Vantagens dos alopoliplóides: manter a natureza híbrida indefinidamente

Mudanças durante o estabelecimento da um autopoliplóide: eliminação de sequências de DNA, expansão heterocromatina,

translocacao recíproca de segmentos de cromossomas: ajudam diferenciar os cromossomas homólogos dos homeologos

Silenciamento nos alopoliplóides: metilação: uso do aza-dC

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progenia anormal::desestabilização da

programação epigenética

Hipermetilação

do gene SUPERMAN

e do gene AG

Hipermetilação

do gene SUPERMAN

Seleção de mutações que afetam o controle das alterações epigenéticas

ddm1: mutação no gene (SNW/SNF2) : fator de remodelação da cromatina;

Mamíferos mudanças na estrutura da cromatina devem anteceder a metilação

Sem fenótipo visível; autofecundação:

reduzido nível de metilação :: nova metilação e silenciamento de genes que são

normalmente expressos e não metilados (SUPERMAN): flores anormais

Paradoxo?

Plantas antisenso para MET1;

redução em 30% no nível de metilação

Problema para a obtenção de plantas transgênicas: - súbito silenciamento do transgenes

1a defesa para superar este problema: selecionar planta transgênica com cópia unica

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Repressores epigenéticos

Genes do florescimento precoce: genes silenciadores: mecanismos epigéneticos no controle do florescimento (repressores epigeneticos)

Genes do florescimento precoce: genes de proteinas associadas a cromatina

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Mutantes tfl2, emf: 1) florescem precocemente,

2) florescem sob DC, flor terminal,

3) proteínas de reserva da semente são expressas antes

35S:EMF1 + DL

35S:EMF1 + DC

35S:TFL1

duas folhas caulinares

flor terminal (2 silíquas)

novo broto terminal

flores e brotos

originados na mesma

regiao

4 sépalas

nova influorescência

Importância da remodelagem da cromatina no controle da expressão gênica

e dos processos de desenvolvimento

Pouco compeendido como esses fatores de remodelagem da cromatina funcionam em plantas

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PGTS (post-transcriptional gene silencing):primeiramente descoberto em plantas

Primeiro gene regulatório para PGTS foi descoberto em Neurospora

Mediado por moléculas de RNA pequenas (<70 nucleotídeos)

PGTS: um poderoso meio para manipular a expressao em sistemas animais::RNAi

PGTS: mais conhecido em Drosophila e levedura (Saccharomyces)

Plantas usam as mudancas epigenéticas para se adaptar a mudancas genômicas ou

ambientais::flexibilidade

Flexibilidade: reprogramação dos estágios de desenvolvimento

Funções: 1) proteção contra efeitos deletérios da transposição de transposons

2) Resistência contra viroses (Produzem dsRNA)

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DICER

Pode ser transmitido entre

células e a longas distâncias

PGTS

(Silenciamento pós-transc.

RNAi (siRNA):

RNA de interferencia

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RNA curto de interferência (siRNA)

Dupla fita

Perfeitamente complementar ao RNA alvo

Direciona a clivagem endonucleolítica

RNA dupla fita perfeitamente ou quase perfeitamente pareado

Não conservado entre as espécies

Originado de um RNA percursor de maior tamanho

Cromossomal ou citoplásmico

Comprimento médio de 25 nucleotídeos

Micro RNA (miRNA)

Fita simples

Parcialmente complementar ao RNA alvo

Mecanismo de ação desconhecido

RNA dupla fita pareado, mas com alças

Frequentemente conservado entre as espécies e filos

Originado de um RNA percursor de maior tamanho

RNA curto temporal (stRNA)

Cromossomal (IGR)

Fita simples

Tamanho médio de 70 nucleotídeos

Parcialmente complementar ao RNA alvo

Inibe a tradução do mRNA

RNA dupla fita pareado, mas com alças

Altamente conservado entre as espécies e filos

Altamente conservado entre as espécies e filos

Originado de um RNA percursor de maior tamanho

Cromossomal (IGR)

Tamanho médio de 70 nucleotídeos

slide27
Mecanismos pelos quais

os microRNAs promovem

o silenciamento

slide29
RNAse tipo III

Complexo de

endonucleases

slide31
Locus de controle do cruzamento sexual em S. pombe (mat2P)

Metilação da histona

Recrutamento: criação de um sítio de

nucleação da heterocromatina

Difusão do processo de diferenciação da heterocromatina:

Silenciamento do locus mat2P

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61 alvos potenciais: 41 são fatores transcricionais

Desen. floral

Desen. floral

Dicer

Dif. Merist. Axilar e da folha

Separação de orgãos

Det. Da especificade de RISC: mutantes: arquit. mod

Desen. floral

Desen. floral

Identidade floral

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Inoculação com o virus da planta transgênica 35SGFP

TRV: tobacco rattle virus

TRV-00: vírus sem inserto

TRV-P: contendo 359 nt 3’ da GFP

TRV-35S: 347 nt do promotor da GFP

Luz UV

Luz UV

Nuclear Run of: taxa de transcrição

PGS

PTGS

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Efeito da proteína HC-Pro no silenciamento sistêmico

Silenciamento

sistêmico

Supressão do silenciamento sistêmico

HC-Pro: proteína viral que

suprime o silenciamento

SilGUS: locus de silenciamento

de GUS

slide36
RNAi: poderosa ferramenta

atFAD2: Desaturase de A. thaliana

slide37
Gene orientação

Senso substitui ccdB

Gene orientação

anti-senso substitui ccdB

AttP1/AttP2: clonagem por

Recombinação utilizando o sistema

Gateway

Amplifico o gene adicionando o sítios attB1 e attB2

Recombinação in vitro utilizando o sistema Gateway

Sistema ccdB: proteína letal: sistema para a seleção do vetor recombinante

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