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Diagnostic bactériologique de Mycoplasma pneumoniae par PCR en temps réel

Diagnostic bactériologique de Mycoplasma pneumoniae par PCR en temps réel Au laboratoire de Pellegrin. M. pneumoniae with respiratory epithelial cells. Infections respiratoires à M. pneumoniae. ● Non commensal : pas de portage sain (sauf période d’épidémie)

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Diagnostic bactériologique de Mycoplasma pneumoniae par PCR en temps réel

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  1. Diagnostic bactériologique de Mycoplasma pneumoniae par PCR en temps réel Au laboratoire de Pellegrin

  2. M. pneumoniae with respiratory epithelial cells

  3. Infections respiratoires à M. pneumoniae • ● Non commensal :pas de portage sain (sauf période d’épidémie) • ● Infections respiratoires aigues, souvent bénignes • ● Transmission aérienne • ● Enfant > 5ans, adulte jeune • Trachéobronchites +++ • Pharyngites • - Pneumopathies atypiques • - Asymptomatique (20%) • ● Mode endémique avec poussées épidémiques • Tous les 4-7 ans • Probable : exacerbation de l’asthme chez enfant et adulte

  4. Manifestations extra-respiratoires  Non spécifiques • ● Lésions cutanées +++ • éruption, exanthème, érythème noueux, Stevens Johnson • ● Atteintes neurologiques • encéphalites, neuropathies périphériques, Guillain Barré • ● Arhrites, arthralgies • ● Cardiaques (rares) • myocardites, péricardites • ● Anémie hémolytiques (rares)

  5. Diagnostic biologique • ● Recherche directe de la bactérie • - Culture • - PCR • ● Recherche indirecte : recherche d'anticorps

  6. Prélèvements pour détection directe • ●Mêmes pour culture et PCR • ● Respiratoires • pvt gorge (infection diffuse) • asp. naso-pharyngée (jeune enfant) • LBA (formes sévères) • expectorations peu adaptées • Autres (rares) • ● Milieu de transport - Milieu 2SP (saccharose-phosphate) - conservation +4°C  24 h, puis -70°C

  7. Culture de M. pneumoniae • Fastidieuse, longue • Exigence nutritionnelles  milieux spéciaux enrichis • Hayflick modifié, SP4 • (20% sérum, extrait levure, -lactamines) • Solide ou liquide • Glucose •  37°C +/- CO2 pendant 2-3 semaines • Prop. métaboliques en milieu liquide • Fermentation glucose •  Changement de couleur du rouge de phénol • Dilutions indispensables (inhibiteurs)

  8. Détection de la croissance en milieu solide ● Aspect des colonies sur agar (37°C, CO2) Loupe binoculaire, 50-300µm 2-3 sem ● Identification : aspect colonies, hémadsorption, PCR

  9. Détection de la croissance en milieu liquide • ● Virage indicateur coloré • - Fermentation du glucose  acidification : virage du rouge de phénol : rouge  jaune • - 2-3 semaines en primo-isolement  M. pneumoniae ● Sensibilité vs PCR: 60%, spécificité : 100%  rare (labo spécialisés)

  10. Détection par biologie moléculaire • ● Hybridation par sonde : peusensible • ● 1ère publication de PCR en 1989(Bernet, JCM, 89) 1989-2003 : 34 articles (Loens, JCM, 03) • ● Cibles variées ATPase, gène tuf ARNr 16S adhésine P1 +++ (meilleure sensibilité) ● Techniques variées - ADN : PCR, PCR multiplex, PCR en temps réel - ARN :NASBA, RT-PCR

  11. Détection par biologie moléculaire (2) • ● Extraction d’ADN • - phénol-chloroforme et précipitation de l’ADN • +/- SDS, protéinase K • - sonication • - ébullition • - kits commercialisés • - Automate (ex: MagNAPure Roche diagnostic) •  Sensibilité: 78-92%, spécificité: 92-100%

  12. Détection par biologie moléculaire (3) • Limites • Méthodes "maison" • Contrôles indispensables - Négatifs - Internes - Extraction • Présence possible comme commensal? • Détection d’organismes non viables • Avantages • Rapidité • Grande spécificité • Bonne sensibilité si infection • Quantification possible • Typage des souches, (groupe 1 et 2) • Autres pathogènes respiratoires (PCR multiplex)

  13. Diagnostic biologique • ● Recherche directe de la bactérie • - Culture • - PCR • ● Recherche indirecte : recherche d'anticorps

  14. Diagnostic indirect sérologique • Très utilisé mais résultat tardif • Cinétique des AC • IgM : 1 sem après début infection, enfants +++ • IgG : pic à 3 semaines, décroissance plusieurs mois • IgA ? • Différentes techniques - agglutination de particules - immunofluorescence - Fixation du complément - ELISA (différents antigènes)

  15. Cinétique des anticorps IgG Quantité d'Anticorps IgM Temps (semaines) Infection

  16. En résumé Diagnostic par PCR + sérologie • Enfants, PCR + IgM (sérum en phase aigue) •  degré maximal de certitude  diagnostic en 1 ou 2 jours • Une PCR positive isolée chez enfant avec pneumopathie atypique : très suggestif • Adultes, PCR + FC ( 1/64) ou IgG X4 entre 2 sérums

  17. Aujourd'hui, recherche de M.pneumoniae Prélèvement de gorge Extraction d'ADN automatisée MagNAPure PCR en temps réel Taqman Prism 7000 Interprétation des résultats

  18. Extraction d'ADN automatisée MagNA Pure LC, Roche diagnostics Principe - Lyse cellulaire et dénaturation des protéines - Digestion des protéines (Protéinase K) - Liaison de l'ADN à la surface de particules de verre magnétiques - Lavages (élimination des protéines, membranes, etc…) - Elution de l'ADN purifié à haute température

  19. Amplification par PCR temps réel • ABI Prism 7000 • PCR en temps réel • - Protocole Taqman • - Cible : Adhésine P1 • 2 amorces : • P1-204 • P1-328 • 1 sonde de 125 bp • P1-284R (FAM-TAMRA)

  20. Sondes Taqman - Principe Hybridation d'une sonde spécifique • Composition de la sonde • ● Fluorochrome émetteur (reporter) en 5' • Ex : FAM 6-carboxy-fluorescein • ● Fluorochrome suppresseur (quencher) en 3' ex : TAMRA 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine •  pas d'émission de fluorescence

  21. Sondes Taqman - Principe • Cette méthode repose sur deux principes : • - la technologie FRET (fluorescence resonance energy transfer) • - l’activité 5’-exonucléase de la Taq Pol Quencher Reporter FP 3’ 5’ FAM, VIC TAMRA 3’ 5’ RP  Spécificité l’amorce pour la PCR  Spécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan

  22. Lumière Sondes Taqman - Principe FP Q R 3’ 5’ 3’ 5’ RP - FRET (fluorescence resonance energy transfer) depuis le reporteur (haute énergie) vers le quencher (faible énergie), pas de signal fluorescent émis par le reporteur quand la sonde est intacte

  23. Q R Q FP 3’ 5’ 3’ 5’ RP - au cours de l’élongation catalysée par la Taq Pol l’activité 5’ nucléase coupe la sonde  libération du reporter R FP 3’ 5’ 3’ 5’ RP - lorsque la polymérisation est complétée, pour chaque molécule d’ADN synthétisée un reporteur émet de la fluorescence.

  24. Sondes Taqman • Avantage : • - Spécificité accrue • Spécificité des primers pour la PCR • Spécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan • - Possibilité de multiplexage avec des sondes portant des fluorochromes différents • Inconvénient : • - Impossibilité de réaliser des courbes de fusion

  25. Protocole opératoire • - Extraits dilués au 1/10ème • - Préparation du Mix • Amorces • Sondes • Mix (dNTP, Taq Polymérse, tampon) • + Ajout de l'échantillon extrait au 1/10ème • - Contrôle interne : mélange précédent + culture extraite de Mpn •  permet de vérifier l'absence d'inhibiteurs de PCR dans l'échantillon • - Amplification d'une gamme de concentration • Culture extraite, pure et dilutions au 1/10ème, 1/100ème et 1/1000ème • - Protocole du thermocycleur • 10min 95°C • 15 sec à 95°C • 1 min à 60°C 40 cycles

  26. Interprétation 10-3 10-2 10-1 pur Témoin + : culture de Mpn extraite et amplifiée pure, 1/10ème, 1/100, 1/1000ème

  27. Patient En rouge : patient positif pour M. pneumoniae

  28. Conclusion • Y a-t-il infection par M. pneumoniae? • PCR positive : oui, très certainement • PCR négative : ne permet pas d'éliminer le diagnostic •  A confronter avec le résultat de la culture et des sérologies

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