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Otras PCR: PCR en tiempo real (cuantitativa)

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Otras PCR: PCR en tiempo real (cuantitativa). Curso PCR 2011-12 Inmaculada Martín Burriel minma@unizar.es. Programa:. Miércoles 18 de enero (10 h) Aula Grados : PCR en Tiempo Real (teoría) Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real: Diagnóstico, expresión génica, análisis mutaciones.

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otras pcr pcr en tiempo real cuantitativa

Otras PCR: PCR en tiempo real (cuantitativa)

Curso PCR

2011-12

Inmaculada Martín Burriel

minma@unizar.es

Curso PCR 2011-2012

programa
Programa:
  • Miércoles 18 de enero (10 h) Aula Grados:
    • PCR en Tiempo Real (teoría)
    • Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real:
      • Diagnóstico, expresión génica, análisis mutaciones.
      • Ejemplo: Perfiles de expresión génica en scrapie
    • Protocolo experimental (15 h) Aula Grados
      • Diseño de primers y sonda (Primer express).
      • Validación de primers.
      • Optimización de la reacción:
        • Matriz de primers
        • Matriz de sonda
      • Curva standard.
    • Normalización de datos de expresión

Curso PCR 2011-2012

slide3

Programa:

  • Jueves 19 de enero (10h) LAGENBIO:
  • Práctica: Realización de una PCR en tiempo real.
  • Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real :
    • Diagnóstico, expresión génica, análisis mutaciones.
    • Ejemplo: Perfiles de expresión génica en scrapie

Curso PCR 2011-2012

pcr cl sico
PCR clásico
  • La cantidad de producto no está relacionada con la cantidad de DNA inicial
  • Herramienta cualitativa (presencia o ausencia)
  • El bromuro de etidio es poco sensible, cuando se detecta ya se ha sobrepasado la fase exponencial

Curso PCR 2011-2012

t cnicas de cuantificaci n
Técnicas de cuantificación
  • Northern Blot

Curso PCR 2011-2012

early expression of p53 responsive genes 24h

PCR Competitivo o PCR “Mimic”

Early expression of p53 responsive genes (24h)

Bax

CD95/Fas

GAPDH

L C 6 8 10 12 M

Curso PCR 2011-2012

Martín-Burriel et al. (2004)

slide8

PCR Competitivo o PCR “Mimic”

Curso PCR 2011-2012

Martín-Burriel et al. (2004) Toxicol Pathol

necesidad de pcr en tiempo real
Necesidad de PCR en tiempo real
  • Necesidad de cuantificar diferencias de expresión de un mRNA
  • Disponibilidad de muy pequeñas cantidades de mRNA en algunas prácticas laboratoriales:
    • Células obtenidas de microdisección por láser
    • Pequeñas cantidades de tejido
    • Biopsias embrionarias
    • Especimenes de gran valor

Curso PCR 2011-2012

slide10

Nuevos químicos

Nuevas plataformas

instrumentales

Permite observar la cinética

de la reacción

PCR en Tiempo Real

Detección de productos

PCR en tiempo real

Curso PCR 2011-2012

fases de la pcr
Fases de la PCR
  • Exponencial: En cada ciclo se dobla el producto.
  • Lineal: enlentecimiento, consumo de componentes, principio de degradación.
  • Meseta: Parada de la reacción, agotamiento de componentes, degradación de productos.

Curso PCR 2011-2012

fases de la pcr1
Fases de la PCR

Logarítmica

Lineal

Curso PCR 2011-2012

detecci n en la fase de meseta
Detección en la fase de meseta

Problemas de cuantificación en la fase de meseta

Curso PCR 2011-2012

pcr en tiempo real
PCR en Tiempo Real
  • Toma los datos mientras se producen.
  • Cuantificación más exacta sin necesidad de métodos laboriosos.
  • Existe una relación cuantitativa entre la cantidad inicial y la cantidad de producto PCR en un ciclo dado.

Curso PCR 2011-2012

flurocromos sybr green
Flurocromos: SYBR Green
  • Se intercala en el surco menor del ADN de doble cadena y emite fluorescencia.
  • No es equimolecular.
  • Necesaria curva de disociación.

Curso PCR 2011-2012

curva de disociaci n
Curva de disociación
  • Tª Melting:
  • Composición de bases del fragmento
  • Tamaño del fragmento.
    • Tm dimeros < Tm fragmento

Curso PCR 2011-2012

curva de disociaci n1
Curva de disociación

Curso PCR 2011-2012

curva de disociaci n2
Curva de disociación

Muestras problema

Controles negativos y sin RT

Curso PCR 2011-2012

ventajas e inconvenientes
Ventajas e inconvenientes
  • PCR con SYBR Green:
    • Más barato
    • Los mismos reactivos sirven para analizar cualquier fragmento
    • La especificidad viene dada únicamente por los primers
    • No es equimolecular
    • Se necesita realizar una curva de disociación

Curso PCR 2011-2012

sondas taqman
Sondas TaqMan
  • Actividad 5’ exonucleasa de la Taq polimerasa.
  • Reporter: FAM, VIC.
  • Quencher: TAMRA.
  • Importante tªm (~70ºC).
  • Equimolecular.

Curso PCR 2011-2012

especificidad
Especificidad

Diseño de sondas entre dos exones

Curso PCR 2011-2012

equimolaridad
Equimolaridad

SYBR Green

TaqMan

Curso PCR 2011-2012

sondas mgb
Sondas MGB
  • NFQ:
  • Quencher oscuro, no emite fluorescencia.
  • Disminuye Baseline.
  • Aumenta sensibilidad.
  • MGB:
  • Se une al surco pequeño.
  • Aumenta la Tªm.
  • Aumenta la eficiencia.

MGB

R

NFQ

Curso PCR 2011-2012

ventajas e inconvenientes1
Ventajas e inconvenientes
  • PCR con Sondas TaqMan:
    • Más caro
    • Utilización de sondas específicas para cada fragmento a analizar
    • La especificidad viene dada por los primers y la sonda
    • Es equimolecular
    • No necesita curva de disociación

Curso PCR 2011-2012

aplicaciones de la pcr tr
Aplicaciones de la PCR-TR
  • Glosario de términos.
  • Cuantificación:
    • Absoluta
    • Relativa
  • Determinación de mutaciones.
  • Ensayos +-

Curso PCR 2011-2012

aplicaciones de la pcr tr1
Aplicaciones de la PCR-TR
  • Glosario de términos.
  • Cuantificación:
    • Absoluta
    • Relativa
  • Determinación de mutaciones.
  • Ensayos +-

Curso PCR 2011-2012

glosario de t rminos
Glosario de términos
  • Cuantificación:
    • Absoluta:
      • Resultado final con unidades (carga viral, copias de mensajero, copias de un gen,...).
      • Se necesita una curva patrón absoluta.
    • Relativa:
      • Resultado sin unidades. Proporciona un porcentaje de incremento o disminución (expresión génica).
      • Se necesita curva patrón (al menos para prueba de primers).

Curso PCR 2011-2012

glosario de t rminos1
Glosario de términos
  • Referencia:
    • Señal utilizada para normalizar el experimento.
      • Pasiva: Fluorocromo en todos los tubos (ROX).
      • Activa: endógena (housekeeping) o exógena (construcción).
  • Calibrador:
    • Muestra que usamos para comparar las demás.

Curso PCR 2011-2012

glosario de t rminos2
Glosario de términos
  • Standard (patrón):
    • Muestra de concentración conocida que nos permite construir la curva de calibrado.
  • Threshold (umbral):
    • Ct es el ciclo en el cual se detecta un incremento significativo de DRn (fluorescencia). El sistema empieza a detectar la señal asociada al incremento exponencial de producto PCR (Fase exponencial)

Curso PCR 2011-2012

aplicaciones de la pcr tr2
Aplicaciones de la PCR-TR
  • Glosario de términos.
  • Cuantificación:
    • Absoluta
    • Relativa
  • Determinación de mutaciones.
  • Ensayos +-

Curso PCR 2011-2012

m todos de cuantificaci n
Métodos de cuantificación
  • Curva estándar
  • Delta Ct
  • Método de Pfaffl

Curso PCR 2011-2012

curva est ndar
Curva estándar

Curso PCR 2011-2012

curva est ndar1
Curva estándar

Curso PCR 2011-2012

curva patr n
Curva Patrón
  • y=ax+b.Y=Ct, X=log [DNA].
  • Relaciona cada concentración con su Ct.
  • Propia de cada pareja de primers.
  • La pendientedepende de la eficiencia de los primers y no debería cambiar entre experimentos:
    • 100% (a=-3.32).
    • 75% (a=-4).
    • Aceptable:-3 ≤ -4.
    • a> -3 contaminación por fluorescencia.

Curso PCR 2011-2012

curva patr n1
Curva Patrón
  • Correlación (R2):
    • R2=1 (perfecta).
    • R2≥0.97 (0.99).
    • Seleccionar el umbral donde R2 sea máxima.
    • Mantener el umbral entre experimentos.
  • Nº de réplicas:
    • Al menos 2 réplicas por muestra.
    • Desviación estándar ≤ 0.38
  • Muestra:
    • Curva absoluta: muestra de [] conocida.
    • Diluciones 1/5.

Curso PCR 2011-2012

1 cuantificaci n absoluta
1. Cuantificación Absoluta
  • Validación de la curva patrón:
    • La precisión de la cuantificación dependerá de la precisión de los patrones.
    • Patrones:
      • DNA plasmídico.
      • DNA genómico.
      • Productos PCR.
      • Grandes oligonucleótidos comerciales.
    • Resultado final relativo a una unidad de interés:
      • Copias/ng de RNA
      • Copias/g tejido, copias/ml sangre.
      • Copias/genoma.
      • Copias/ célula.

ATENCION

DENOMINADOR

Curso PCR 2011-2012

1 cuantificaci n absoluta1
1. Cuantificación Absoluta
  • Posibles curvas de calibrado (Expresión génica):
    • Productos de RT-PCR u oligonucleótidos:
      • Rápido, conocimiento preciso de [DNA].
      • Inestable, problemas en la reamplificación.
    • DNA recombinante:
      • Muy estable, sin problemas de amplificación, talla similar a transcritos.
      • Construcción del DNArec, no tiene en cuenta la eficacia de la RT.
    • RNA recombinante:
      • Mimetiza la situación real de retrotranscripción (añadir RNA background).
      • Muy inestable, clonación complicado, purificación, problemas de almacenamiento.

Curso PCR 2011-2012

1 cuantificaci n absoluta2
1. Cuantificación Absoluta
  • Puntos críticos de la curva patrón:
    • DNA o RNA puro y muy concentrado.
    • Exactitud en la medida de la concentración inicial (7 veces).
    • Pipeteo apropiado: dilución del DNA o RNA original hasta concentraciones similares a las muestras biológicas (106-1012).
    • Estabilidad de las muestras patrón (RNA).

Curso PCR 2011-2012

2 cuantificaci n relativa
2. Cuantificación Relativa
  • Curva patrón:
    • Sencillez en la preparación.
    • La cantidad de producto (n veces) se refiere a la obtenida en el calibrador (1x).
    • No hay unidades.
    • Se puede utilizar cualquier tipo de patrón para la obtención.

Curso PCR 2011-2012

2 cuantificaci n relativa1
2. Cuantificación Relativa
  • Puntos críticos de la curva patrón:
    • Dilución adecuada del RNA o DNA patrón.
    • La utilización de las mismas muestras en placas distintas permite comparar resultados.
    • Se pueden utilizar patrones DNA para análisis de RNA.
    • Se necesitan curvas patrón para el gen de estudio y el control endógeno.

Curso PCR 2011-2012

cuantificaci n de la expresi n g nica
Cuantificación de la expresión génica

Referencia activa:

  • Control de la eficiencia de la Retro-transcripción.
  • Control de la eficiencia de la extracción de RNA.
  • Buscar referencias bibliográficas.
  • Utilizar tres endógenos.

Curso PCR 2011-2012

an lisis de expresi n con curva patr n

0.49/0.0121

= 24.54

0.627/0.38

Análisis de expresión CON curva patrón

Gen Referencia: GAPDH

Gen Estudio: SPP1

21.58

27.68

16.62

27.36

-0.2

0.627

-0.3

0.49

-1.92

0.0121

-0.42

0.38

Cantidad relativa

Cantidad relativa

T0

T7

Qgen trat/Q norm trat

=Fold Change

Q gen Ctrl/Q norm Ctrl

Curso PCR 2011-2012

cuantificaci n relativa
Cuantificación Relativa

La eficiencia de la PCR puede enmascarar resultados.

Curso PCR 2011-2012

m todo de pfaffl 2001
Método de Pfaffl (2001)

Eficiencia: pendiente de la curva patrón

Curso PCR 2011-2012

http://pathmicro.med.sc.edu/pcr/dnaveff.jpg

slide46

Método de Pfaffl (2001)

  • eficiencia =10-1/pendiente
  • Si la eficiencia es del 100% e=10-1/-3.32=2

Curso PCR 2011-2012

an lisis de expresi n sin curva patr n
Análisis de expresión SIN curva patrón
  • Método de comparación de Ct= 2-DDCt

DDCt= DCt , muestra-DCt, calibrador

DCt , muestra: Valor de Ct para una muestra normalizado con el del control endógeno.

DCt , calibrador: Valor de Ct para el calibrador normalizado con el del control endógeno.

Expresión gen/ Expresión basal del gen

=2-DDCt

Expresión endógeno/ Expresión basal endóg

Curso PCR 2011-2012

an lisis de expresi n sin curva patr n1
Análisis de expresión SIN curva patrón
  • Método de comparación de Ct
  • Se basa en la eficiencia de los primers
  • Se refiere a la muestra con mayor cantidad de gen de estudio (o menor Ct)
  • Q = e(menor Ct- Ct muestra)
  • e =10-1/pendiente
  • Si la eficiencia es del 100% e=10-1/-3.32=2

Ejemplo

Curso PCR 2011-2012

2 cuantificaci n relativa2
2. Cuantificación Relativa
  • PCR Múltiple:
    • Amplificación del gen de interés y el endógeno en el mismo tubo.
    • Reporter: 6-FAM y JOE.
    • Evitar competición en la reacción:
      • Limitar la concentración de primers del gen más abundante.

Curso PCR 2011-2012

cuantificaci n relativa1
Cuantificación Relativa
  • Elección del método:
    • Estudio del gen de interés y del endógeno en tubos distintos y usar curva patrón:
      • Rápida optimización y validación.
    • Utilización del método 2-DDCt :
      • Se necesitan eficiencias de amplificación similares.
      • No necesita curva patrón.
      • Elimina los errores de dilución de la curva patrón.
      • Preferible el método de Pfeffl una vez calculada la eficiencia
    • PCR Múltiple:
      • Más puesta a punto.
      • Mayor rapidez de análisis.

Curso PCR 2011-2012

aplicaciones de la pcr tr3
Aplicaciones de la PCR-TR
  • Glosario de términos.
  • Cuantificación:
    • Absoluta
    • Relativa
  • Determinación de mutaciones.
  • Ensayos +-

Curso PCR 2011-2012

polimorfismo de snps
Polimorfismo de SNPs
  • Sondas alelo-específicas.
  • Utilización de sondas MGB/NFQ: Mayor discriminación.
  • Utilización de oligos alelo-específicos y SYBR Green.
  • Las curvas de disociación discriminan alelos.

Curso PCR 2011-2012

slide53

Metodología

G

Sonda 1

Forward

A

Sonda 2

Reverse

ryr-1:

CTG TGT TCC CTG TGT GTG TGC AAT GGT GTG GCC GTG GC TCC AAC

CAA GAT CTC ATT ACT GAG AAC TTG CTG CCT GGC CGC

T

C

FAM

VIC

Protocolo:

  • Pre-lectura:

60ºC 1min

  • PCR:

95ºC 10min

92ºC 15sec

60ºC 1min

(x50)

  • Post-lectura:

60ºC 1min

Curso PCR 2011-2012

slide54

Resultados

CT

CC

TT

NTC

Curso PCR 2011-2012

aplicaciones de la pcr tr4
Aplicaciones de la PCR-TR
  • Glosario de términos.
  • Cuantificación:
    • Absoluta
    • Relativa
  • Determinación de mutaciones.
  • Ensayos +/-

Curso PCR 2011-2012

ensayos
Ensayos +/-
  • Se marca el ensayo con sonda TaqMan o SYBRGreen.
  • Adición de un control interno positivo (control de amplificación).

Eliminar Falsos Negativos

Curso PCR 2011-2012

programa1
Programa:
  • Viernes 14 de enero (9:30 h) Aula Máster:
    • PCR en Tiempo Real (teoría)
    • Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real:
      • Diagnóstico, expresión génica, análisis mutaciones.
      • Ejemplo: Perfiles de expresión génica en scrapie

Curso PCR 2011-2012

slide58

Programa:

  • Miércoles 20 de enero Aula Máster :
    • Práctica: Realización de una PCR en tiempo real.
    • Protocolo experimental:
      • Diseño de primers y sonda (Primer express).
      • Validación de primers.
      • Optimización de la reacción:
        • Matriz de primers
        • Matriz de sonda
      • Curva standard.
    • Normalización de datos de expresión
    • Ejemplo: estabilidad de HKG en scrapie.

Curso PCR 2011-2012

dise o primers
Diseño primers
  • Tamaño amplicon: 50-150pb
  • %GC: 20-80%
  • Máximo 2/5 G o C en el extremo 3’
  • Longitud: 9-40pb (mejor 20pb, no se recomiendan longitudes <18pb)

Curso PCR 2011-2012

dise o de primers
Diseño de primers
  • Tm: 58-60ºC
    • Tm: Tª en la que el 50% de las cadenas está unida y el 50% despegada
    • Si se pega más del 50%más posibilidad de inespecificidades
    • En tiempo real: Tª=Tm
  • Diferencia de Tm entre los dos primers < 2ºC

Curso PCR 2011-2012

dise o de primers1
Diseño de primers

Primer F: Tm 58ºC

Primer R: Tm 60ºC

PCR: 60ºC

[Primer F]

Curso PCR 2011-2012

matriz de primers
Matriz de Primers

Curso PCR 2011-2012

slide64

Matriz de primers

< Ct  > Sensibilidad

> Rn  primers no limitantes

Curso PCR 2011-2012

dise o de sondas
Diseño de sondas
  • Tm sonda 10ºC > Tm primers
  • Tm 70ºC la sonda se une inmediatamente antes de la mayor eficiencia de la polimerasa
  • GC: 20-80%
  • Longitud: 9-40b (si >30b sonda MGB)
  • Nunca puede haber G en el extremo 5’ (quencher natural)
  • <4G continuas
  • Procurar [C]>[G]

Curso PCR 2011-2012

matriz de sonda
Matriz de sonda
  • Se realiza tras la optimización de los primers (para ello sonda a 250nM)
  • Utilizar distintas [sonda]: de 25nM a 225nM

Curso PCR 2011-2012

slide67

Matriz de sonda

250 nM

200 nM

150 nM

100 nM

50 nM

< Ct  > Sensibilidad

> Rn  no limitante

Curso PCR 2011-2012

slide68

Recta patrón Gen Referencia

Nos muestra la eficiencia de los primers:

Curso PCR 2011-2012

control de la curva patr n
Control de la curva patrón
  • Seleccionar el umbral (manualmente) para obtener la mayor correlación (>0.99)
  • Asegurarnos de que las curvas de melting son adecuadas
  • Confirmar que las pendientes de las muestras son iguales en vista logarítmica
  • Eliminar muestras de las diluciones que se entrecrucen
  • Eliminar muestras que se amplifican a Ct<10
  • La curva debe tener 5 o + puntos

Curso PCR 2011-2012

etapas del an lisis de expresi n
Etapas del análisis de expresión
  • Extracción de RNA
  • Retrotranscripción
  • Análisis de la expresión del gen (genes) de referencia
  • Análisis de la expresión del gen de estudio
  • Normalización
  • Análisis de los resultados

Curso PCR 2011-2012

retrotranscripci n
Retrotranscripción
  • El paso más delicado por la baja eficiencia de la enzima
  • Distintas retrotranscriptasas en función del experimento:
    • Expresión génica (MLMv o modificaciones)
    • rTth DNA polimerasa (virus y fragmentos de RNA difíciles)
  • Primers:
    • Random Hexamers expresión
    • Poly(dT)
    • Específico (la eficiencia de la RT dependerá del primer) virus

Curso PCR 2011-2012

errores m s comunes
Errores más comunes
  • Mal diseño de primers y sondas:
    • Utilizar software:
      • Obtener la Tm óptima,
      • Evitar complementariedad entre primers,
      • Observar estructura secundaria
      • Atención al tamañio del amplicón
    • Elegir primers en la unión de exones
    • Eficiencia pobre
  • Pobre calidad del RNA:
    • Los amplicones cortos (70-250bp) toleran cierta degradación
    • Para una buena cuantificación, evitar la degradación

Curso PCR 2011-2012

errores m s comunes1
Errores más comunes
  • No utilizar master-mix:
    • Los errores de pipeteo se amplifican
    • Minimiza la variación entre muestres y réplicas
    • Rox en master-mix.
  • Contaminación:
    • Utilizar siempre un NTC
  • No utilizar un “–RT” control

Curso PCR 2011-2012

errores m s comunes2
Errores más comunes
  • Usar un control de normalización inadecuado:
    • Elegir controles estables
    • ¿Existen referencias bibliográficas en nuestro modelo?
  • No hacer curvas de disociación con SYBR-Green:
    • Podemos “cuantificar dímeros” o bandas contaminantes
  • No elegir adecuadamente “baseline” y “threshold”
    • Baseline: 2 ciclos antes que el Ct de la muestra más abundante
    • Threshold: en fase exponencia (al menos a 10 desviaciones estándar del inicio de baseline
  • Utilizar curvas estándar de rango inapropiado

Curso PCR 2011-2012