Bevezetés a Bioinformatikába Fehérjék t é rszerkezet e

1. Bevezetés a BioinformatikábaFehérjék térszerkezete Kozlovszky Miklós m.kozlovszky@ieee.org 3. Előadás

2. Ismétlés • Információ kódolás • Jelkészlet: IUPAC • Fileformátumok • Genbank • PDB • FASTA • ASN.1

3. Ismétlés II. • Enzimek: szubsztrát->tranzíciós állapot-> produktum • Kötődési modellek • Kulcs-zár • Indukált illesztés • Aktív hely, szubsztrát kötő hely • Fehérje adatbázisok • PDB, Swiss-prot

4. Felhasználási területek I. • Molekulastruktúra megjelenítés • Számítógépes grafikával • Aktív centrumok meghatározása • Másodlagos szerkezet analízis • Domén identifikáció • Molekulageometria analízis • Molekulák közötti kapcsolati területek • Molekulafelszín vizualizáció • Elektrostatikus potenciál számolás

5. Fehasználási területek II. • Fehérjeazonosítás • Aminosav összetétel/tömeg/izoelektromos pont stb. alapján • Struktúra klasszifikáció, fehérje azonosításhoz • Struktúra illesztés, összehasonlítás • Rokonsági (pl. evolúciós) kapcsolatok kutatása • Fizikai tulajdonságok predikciója a szekvenciából • Térszerkezet-predikció • Oldószer általi hozzáférhetőség predikciója • Transzmembrán hélixek predikciója • Kölcsönhatások predikciója • Töltésviszonyok predikciója • Felszíni struktúrák, üregek meghatározása (hozzáférési pontok!)

6. Fizikai tulajdonságok és a szekvencia I. • Aktív területek jóslása • http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/ligplot/ligplot.html • Topológia-cartoon (segít a vizualizációban) • http://www3.ebi.ac.uk/tops/

7. Fizikai tulajdonság és a szekvencia II. • Naccess (Oldékonyság/oldhatóság) • A hozzáférhető molekulákat számolja PDB file-ból • http://wolf.bms.umist.ac.uk/naccess/ • Elektrosztatikus potenciál számolás + molekula dinamika+ brown mozgás szimulációk • UHBD (University of Houston Brownian Dynamics) • http://adrik.bchs.uh.edu/uhbd.html

8. Struktúra osztályozás • Adatbankok • SCOP (structural Classification of Proteins) • http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/ • CATH • hasonló a SCOP-hoz, csak más szempontok alapján osztályoz • http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/cath/cath.html

9. Kérdés:Miért kell térszerkezetet jósolni?

10. Válaszok • A kísérletek • költségesek • nehezen automatizálhatóak • sok időbe kerülnek • In silico: • Olcsó, „gyors”,automatizálható => pontatlan • Ha tudjuk a szerkezetet • következtethetünk a funkcióra • Ha többféle vizsgálatot használunk csökken a tévedés veszélye

11. Szekvencia<?>struktúraSzent grál keresése CASP • Aminosav szekvenciából struktúra jóslás • Két évente rendezik a versenyt • http://predictioncenter.org/ • Népszerű verseny (sok algoritmus) • A verseny nyílt, az algoritmusokat többféle szempont alapján rangsorolják

12. Másodlagos struktúrajóslás pontosság mérése • Q3 mérőszám • N-aminosavak száma a láncban • Nr3-helyesen jósolt struktúra (alfa-hélix, stb.) • Sov mérőszám (Segment overlap score) • (Burkhard Rost et al.) • Erősebb mint a Q3 • Büntetőpontokat ad ha nem összefüggő a szekvencia (lukakért) • Megjegyzés • Legyünk mindig konzervatívak, érdemes átlagos értékekkel számolni, • Egyszerű statisztikák, nincs bennük „fontossági” mérőszám Szürke szín=egyezés

13. Megoldások, eszközök I. • Első generációs algoritmusok (70-es évek) egyszerű aminosav sorrenden alapultak: • Chou & Fasman (1974) (Aminosav táblázatból) • Lim (1974) • Garnier, Osguthorpe & Robson (1978) • Q3 pontosság kb: 50-55% • Második generációs algoritmusok (80-as évek)Peptid szegmenseken alapulnak: • GOR III (1987) ismert aminosavsorrendből felállított struktúrák alapján gyakoriságot vizsgál • Neurális hálózatokkal: Qian & Sejnowski (1988) • Korábbi algoritmusokból kapott tudást MI-vel megtámogatták • Q3 pontosság kb:60-65%

14. Megoldások, eszközök II. • Harmadik generációs algoritmusok (90-es évek)Evolúciós információk alapján, többszörös szekvencia illesztéssel • PHD (Q3 ~ 70%) -Rost B, Sander, C. (1993) • PSIPRED (Q3 ~ 77%) - http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/ • Jones, D. T. (1999) • Sok éven át vezette a CASP-ot • Negyedik generációs algoritmusok? • Max 88% felső korlát?

15. Strukturálatlan részek predikciója • Viszonylag új terület • A genom kb. 1/5-e ilyen területeket kódol • DISOPRED (2004, Ward et al.) • http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/disopred/

16. Viszgált Szekvencia Fold adatbázis Hasonlóság mérése Pont, vagy potenciál Fold recognition

17. Megoldások, eszközök • THREADER, Jones et al. (1992) • Nem próbál pontos struktúrát meghatározni • Elég hatékony, de lassú is • Kisebb szerkezeti struktúrákhoz jól használható, teljes modellekre kevésbé • Az eredmények nehezen értelmezhetők • ftp://bioinf.cs.ucl.ac.uk/pub/threader/manual.pdf

18. Transzmembrán-hélixek • Nagyon fontos terület (80-as évektől) • (Sejt)membránokhoz/ba kapcsolódás • Membránfehérjék szükségesek alapvető dolgokhoz pl:fotoszintézis,idegi aktiváció,légzés,immunválasz,sejtközötti jelátvitel,stb…. • Fehérje struktúrákat keresünk, melyek: • Adott helyeken hélix szerkezetűek (17-25 aminosav hossz) • Meghatározott helyeken hidrofób struktúrájuk van • Használható szoftverek • TMHMM • www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/ • TOPPRED2 • http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/toppred.html • MEMSAT • http://saier-144-37.ucsd.edu/memsat.html • Kb. 90-95%-os pontosság

19. 3D Jóslási módszerek általánosságban • Egyszerűnek tűnik, de nem az… • Két út • Homológia modellezés • (Összehasonlítjuk ismert dolgokkal) • http://salilab.org/modeller/ • Ab-initio-jóslás • (Kezdeti szekvenciából jósolunk) • Már a másodlagos szerkezeteknél is gondban vagyunk, hátmég ha bonyolítjuk a dolgot! (Samudrala- RAMP) • Harmadik út... • Hibrid módszereket alkalmazunk

20. Modell ellenőrzés • Fontos, mert messze vagyunk a 100%-tól • VERIFY-3D • http://nihserver.mbi.ucla.edu/Verify_3D/ • PROCHECK • http://www.biochem.ucl.ac.uk/~roman/procheck/procheck.html • WHAT IF • http://swift.cmbi.kun.nl/whatif/

21. Fehérjeszerkezet megismerési metodikák (ismétlés) • Különválasztás legjellemzőbb tulajdonságok alapján • Méret (SDS-poliakrilamid, gélelektroforézis, ultracentrifugálás, gélszűrés és kromatográfia • Oldékonyság (oldószerek, detergensek,pH érték) • Töltés (elektroforézis,elektroforézis pH grádiensben) • Kötődési affinitás • Aminosavak mennyiségi meghatározása • Aminosav sorrend meghatározása • 3D fehérjeszerkezet (rtg. kristallográfia, NMR)

22. Elektroforézis • Elektroforézis (ismétlés) • Oldatban lévő különböző molekulatömegű és töltésű (ionizált) részecskék elektródák (anód: +, katód: –) közötti elektromos erőtér hatására ellentétes töltésük szerint vándorolnak. • Markerek használata • Gél mint vivő közeg (pl. poliakrilamid – PAGE, agaróz,stb.) • nx100V,mx10perc, a végén festés/rögzítés • A gél (vivőanyag) pórusmérete változtatható • Elektroforézis pH grádiensben

23. Tömegspektrometria – mass spectrometry - • Jelenleg az egyik leghatékonyabb vizsgálati módszer • J.J.Thomson (1910-es évek) – izotóp kutatás • 1950-es évektől szerves vegyületekre is alkalmazzák • MA: Gyors (20-30 perc)->összetett elegyek minőségi és mennyiségi elemzése • Ionos részecskéket választunk el fajlagos tömegük (töltésegységre eső tömegük: m/z) szerint csökkentett nyomáson, elektromos, vagy mágneses mezők segítségével. • Felhasználási területek:BioTech, gyógyszerkutatás, környezetvédelem, ellenőrzés (pl.:víz, élelmiszer)

24. Tömegspektometria alapja • Az elválasztott ionok intenzitását folyamatosan mérjük, s így egy ionáram intenzitás - fajlagos tömeg függvénykapcsolathoz, az ún. tömegspektrumhoz jutunk. • Nincs két olyan szerves vegyület, amelyiknek a tömegspektruma (a legintenzívebb ion intenzitására normált, ún. karakterisztikus tömegspektruma) azonos lenne. • Magyarul:megkapjuk a vizsgált peptidek pontos molekulatömegét. Ennek alapján a fehérje azonosítható.

25. Egy általános tömegspektrométer részei • Mintabeviteli rendszer • Ionforrás, ionoptikával, mely ionokat gerjeszt az alábbi módszerekkel: • Elektronütközéssel • 50-75eV energiájú elektronokat ütköztet • Gáz fázis->bomlás nélkül kell párologtatni a vegyületet,stabilitás! • Elterjedt (adatbankok) • Kémiai ionizációval (reagens gázzal ütközteti a vegyületet) • Gyors atom bombázással (FAB) (hőérzékenyek dolgokhoz használják) • Mátrix közvetítésével végzett lézer deszorpciós ionizációval (kíméletes!) • lásd a következőkben:MALDI • Analizátor • Detektor • Vákuumrendszer • Számítógép szabályzó és adatkezelő (gyűjtő, feldolgozó, archiváló) funkcióval.

26. MALDIMatrix-Assisted Laser Desorption Ionization • Jól szabályozható ionizáció • lehetővé teszi termikusan igen érzékeny anyagok (enzimek, hormonok, nagy tömegű biomolekulák, fehérje szekvenciák, stb. tömegspektrometriás vizsgálatát. • A lézer forrásból származó gerjesztő energiát egy mátrix veszi fel és közvetíti a vizsgálandó molekulák felé. • A keletkezett ionokat azután egy nagy térerejű gyorsító rendszer (60-100 kV) kiszívja • Deszorbeálja a kondenzált fázisból • Azután a detektor érzékeli

27. Analízátor típusok • Az elválasztás többféle elv alapján oldható meg. • Repülési idő (TOF: time of flight) -> TOF-MALDI • Analizátos lehet még: elektromos (pl. kvadropól, rádiófrekvenciás, ioncsapda, omegatron), mágneses analizátorú, elektrosztatikus, kettős fókuszálású, tandem, stb. • eV = KE = mv2/2 Elektr. mezőenerg. Kinetikus energia Tömeg-töltés (Mass-to-charge) arány

28. Röntgen kristallográfia • Kristályosítani kell hozzá az anyagokat • Nagy és tiszta protein kristályok • Nehéz előállítás • Sok fehérjét nem „lehet” kristályosítani • Pl. a vízre érzékeny membránproteinek elveszítik formájukat

29. NMRNuclear Magnetic Resonance • Pauli (1924-25): „az atommagnak is van impulzus, és ezáltal mágneses momentuma” • Edward M. Purcell & Felix Bloch (1946) • Több mint fél tucat Nobel-díj idáig az NMR kutatások segítségével • Felhasználási területek: • Gyógyszeripar, anyagtudományok, kémia, élelmiszeripar,stb. • Egyszerüsített működése: • Az anyagot rádióhullámokkal gerjesztjük, miközben erős elektromos térben van • Figyeljük a választ, nagyon érzékenyen :)