Plate-forme de Recherche Clinique en CYTOMIQUE

1. Plate-forme de Recherche Clinique en CYTOMIQUE • Biomarqueurs cellulaires innovants • CPER 2007-2013: Innovations thérapeutiques et Technologies de la Santé (ITTS-CIC-B) • Plateau technique au sein du Pôle Laboratoires du CHUN (Pr F Plenat) dédié à la recherche clinique et translationnelle • Mutualisation des compétences • Complémentarités humaines et technologiques • Ouverture régionale et interrégionale • Ensemble type « Flow cytometry core facility » • Cytométrie en flux multiparamétrique • Cell Search Veridex • Image Stream System (Amnis) • Une démarche commencée en 2005!

2. Cytométrie de flux multiparamétrique • Navios (Beckman Coulter) • Software Kaluza • CMF 3 lasers 10 couleurs <… 5 • Laboratoire d’Immunologie (Pr GC FAURE, Pr MC BENE, Dr M de CARVALHO) • Service d’Hématologie biologique (Pr T LECOMPTE, Dr V LATGER) • Unité de thérapie cellulaire et tissulaire (Pr JF STOLTZ, Pr A DALLOUL) • Anatomopathologie (Pr F PLENAT, Dr K MONTAGNE)

3. CancéropoleCytométrie de flux multiparamétriqueEvénements rares et populations discrètes… après « single platform » et • Onco-Hématologie • NoE European Leukemia Net • STIC DHOS Maladie résiduelle (LAL, LAM) • Maladie Résiduelle LLC • Myélodysplasies • Projet INCA SIGLAM • Phase périphérique des LMNH • Réponse immunitaire anti-tumorale et thérapie cellulaire • Tregs, cellules dendritiques, cellules NK • Production cytokiniques spécifiques d’Ag • Microparticules et cellules endothéliales

4. Cytométrie de flux multiparamétrique (2)MC Béné, au nom du GEIL, GTLLF, GOELAMSMoelle normaleMaladie résiduellevalorisation démarche détection et quantification d’événements rares au sein des « bermudes » CD13 SSC CD45 CD34

5. Publications récentes • Four- and five-color flow cytometry analysis of leukocyte differentiation pathways in normal bone marrow: a reference document based on a systematic approach by the GTLLF and GEIL. • Arnoulet C, Béné MC, Durrieu F, Feuillard J, Fossat C, Husson B, Jouault H, Maynadié M, Lacombe F. • Cytometry B Clin Cytom. 2010 Jan;78(1):4-10. • How and why minimal residual disease studies are necessary in leukemia: a review from WP10 and WP12 of the European LeukaemiaNet. • Béné MC, Kaeda JS. • Haematologica. 2009 Aug;94(8):1135-50.

7. ELN http://www.leukemia-net.org/content/diagnostics/diagnostics/morphology • Consensual Documents provided by WP10 • Created by: M.C. Béné , generated 2008/01/12 , last changed: 2008/04/22 • …. useful for the immunophenotypic diagnosis of leukemias by flow cytometry. • Flow cytometry atlas • Created by: F Lacombe, C Arnoulet, F Durrieu, J Feuillard, C Fossat, B Husson, H Jouault, MMaynadié, MC Béné ,generated 2008/07/12 , last changed: 2009/01/04

8. Cytométrie de flux multparamétrique (2) • Réponse immunitaire anti-tumorale spécifique (M de Carvalho, P Eschwege + …) • Antigènes candidats (cancer prostate) • Problématique: événements rares + caractérisation multiparamétrique phénotypique et fonctionnelle de sous populations cellulaires • Signatures cytokiniques • Transfert de l’expérience acquise dans la réponse spécifique anti-mycobacterium tuberculosis et anti-adenovirus

9. Cytométrie de flux multiparamétrique (3) • Microparticules, thrombose et cancer (V Latger-Cannard, Th Lecompte) • Standardization of platelet-derived microparticle counting using calibrated beads and a Cytomics FC500 routine flow cytometer: a first step towards multicenter studies? • Robert S, Poncelet P, Lacroix R, Arnaud L, Giraudo L, Hauchard A, Sampol J, Dignat-George F. • J Thromb Haemost. 2009 Jan;7(1):190-7. Epub 2008 Oct 18.

10. Projets en cours • Hémoglobinurie paroxystique nocturne (HPN) (V Latger, MC Béné) • Déficit en molécules GPI-linked • Lymphocytoses B (JF Lesesve, MCB) • SIGLAM (MCB - INCA) • Activation intracellulaire • Septiflux recherche translationelle Inserm • (J Feuillard Limoges, S Gibot et Immuno Nancy) • Marqueurs lymphoïdes et monocytaires

11. Cell Search Veridex® • Combinaison de méthodes • Immunologiques spécifiques • Séparation immunomagnétique • Quantification en imagerie photonique automatisée • Standardisation et automatisation de la phase préparative • Très grande sensibilité (5 évts/tube de 7,5mL) soit #10-7 • outil de choix pour l'étude des cellules endothéliales circulantes en recherche clinique. • Validation antérieure en recherche clinique pour les cellules tumorales circulantes pour des études pronostiques. • Capacités d’isolement des cellules en vue d’études moléculaires complémentaires

12. Projets Cell Search Cancéropole et au-delà… • Cellules Tumorales Circulantes (CTCs) • Sein (CIC Cancérologie CHU-CLCC E Luporsi – GSK/NOVARTIS – INCA?) • Poumon • AO Cancer 2009 Région Lorraine, Nancy Y Martinet, JM Vignaud comparaison ISET STIC Nice, Strasbourg P Oudet, M Beau-Faller • Prostate (Nancy Urologie: J Hubert, P Eschwege; Paris: S Loric LIBM) • Validation clinique en réseau interrégional, national, voire européen (IMI?) • Cellules Endothéliales Circulantes (CECs) • Thérapies antiangiogéniques • Inflammations: sepsis (CPRC S Gibot) • Neuroectodermoses: Sclérose tubéreuse de Bourneville (J Hubert, Necker)

13. Résultats littérature • Stratification • Baseline levels predicts outcome • Changes predicts survival

14. Cell search CTCs (1) • CERONC – Poumon (Y Martinet, E Quoix, M Beau-Faller, P Oudet) • Evaluation de l’intérêt clinique de la détection des cellules tumorales circulantes dans le cancer bronchique métastatique • Avec ajout de marqueurs d’intérêt (EGFR, X) • Isolement des cellules en vue d’études moléculaires • CERONC – Prostate (P Eschwege, J Hubert, D Peiffert) • Evaluation préthérapeutique

15. Autres projets CTCs • Cancer Poumon • Projet CIRCUBRON • C Clement Duchene • Cancer ORL • Collaboration CAV: • G Dolivet, R Mastronicola • Dilution limite • B Faivre: Thrombose, Hémostase et Cancer ORL

16. Cell Search CECs (2) • Projet Sepsis • CPRC CHU Nancy (Pr S Gibot, GCF) • Quantification des CEC • Isolement des CECs pour études moléculaires • Projet STB (Sclérose Tubéreuse de Bourneville) • Evaluation des CECs comme biomarqueurs d’angiogénèse pour l’évaluation et le suivi des tumeurs vasculaires rénales • Demande en cours ASTB, PHRC maladies rares (GCF, Pr J Hubert, Necker – D Joly, Lyon – O Rouvière)

17. Sepsis…. STB • Résultats préliminaires • Collaboration Bordeaux • Sepsis (CPRC) • C3, B2 • Suivi séquentiel

18. Autres projets CECs • Hémangiomes (propranolol-6) • Maladie Rendu-Osler • Vascularites (10) • Suites infarctus (<20) • Anévrysmes aortiques? • Eclampsie (2) • Thérapeutiques anti-angiogéniques (12)

19. Imagerie en fluxImage stream X AMNIS® • Le système AMNIS®, système d’imagerie en flux combinant cytométrie en flux et imagerie photonique • Observation directe, de la localisation précise, cellule par cellule, des marqueurs fluorescents utilisés pour identifier: membrane, organites intracellulaires, noyau. • Parmi les applications réalisables en simultané • Marquages membranaires multiples et colocalisation de marqueurs de surface • Marquages nucléaires (FISH en suspension) • Translocation nucléaire, • Apoptose • Etudes fonctionnelles • Coopérations cellulaires (synapse immunologique)

20. Signalisation Cellulaire Cycle Cellulaire Dommage de l’ADN Mort cellulaire Analyse Morphologique Interactions cellulaires Image stream X AMNISApplications…. etc • Biologie cellulaire – Immunologie • Cancérologie

21. detector Spectral decomposition element detector Spectral decomposition element cells in flow cells in flow autofocus velocity detector autofocus velocity detector brightfield illuminator laser brightfield illuminator laser ImageStream Layout

22. Untreated MCP-1 9.5 60.9 Untreated MCP-1 Shape Change, Primary Monocytes MCP-1 causes a ‘loss in circularity’ in the majority of the monocytes Circularity = average radius divided by radial variance

23. NF-kB translocation in whole blood subsets Monocytes T cells

24. Label pDC with BDCA PE, CD71 or CD107a FITC Collect 20,000 event image files on the ImageStream Quantify: Internalization and colocalization of CpGB to endosomes and lysomes Internalization / trafficking in primary cells Chongwei Cui Dr. Pat Fitzgerald-Bocarsly UMDNJ Incubate PBMC with CpGB

25. T cell / APC interactions 17.6 1.3 Identification of molecular recruitment to the immune synapse. Dr. Brandon BurbachUniversity of Minnesota

26. EDF – FISH analysis Jurkat cells probed with ChrX (Spectrum Green) and Chr8 (Spectrum Orange) ImageStream: Standard Imaging Cells exhibit common artifacts associated with defocus making spot counting difficult ImageStream: Extended Depth of Field Imaging Same sample (different cells) with WFC element. FISH spots maintain size independent of focal position within nucleus

27. Cell Cycle / Mitosis / Apoptosis CV= 4.0 Interphase Prophase Metaphase Anaphase Telophase Atypical Apoptotic • • HL60 cells were labeled with anti-HLA AF488 and DRAQ5 • • DNA condensation pattern and Brightfield contrast help distinguish the phases of mitosis from apoptotic and interphase nuclei

28. Plate-forme de recherche clinique en CYTOMIQUE • Biomarqueurs cellulaires innovants • CPER: Innovations thérapeutiques et Technologies de la Santé (ITTS-CIC-B) • Plateau technique au sein du Pôle Laboratoires du CHUN (REDIF: Pr Th Lecompte; CIC-B Pr GC Faure) dédié à la recherche clinique • Ensemble type « Flow cytometry core facility » • Cytométrie en flux multiparamétrique • Cell Search Veridex • Image Stream System (Amnis)