Genom-screening med Illumina SNP-array Beskrivelse af beadchippen

1. Genom-screening med Illumina SNP-array • Beskrivelse af beadchippen • Princippet bag detektion af variationer med SNP-array • SNP-array fremgangsmåde • Eksempler på resultater • Klinisk Genetisk Afdeling, Laboratoriecenteret, Sygehus Lillebælt, Vejle

2. Hvad kan vi bruge genom-screening med SNP- array til? • Genom-screening med array bygger videre på den traditionelle kromosomundersøgelse (båndfarvnings-analyse). • Array-teknologien er i stand til at detektere sygdomsgivende variationer/ubalancer (deletioner og duplikationer) ned til en størrelse af ca. 50 kb og har ca. 200 gange så høj opløsning som en traditionel kromosomundersøgelse. • Array-teknologien kan ikke detektere balancerede translokationer og inversioner • Hele genomet screenes i en undersøgelse Båndfarvning 14 Mb deletion SNP-array 2,6 Mb duplikation

3. Array analyse på Klinisk Genetisk Afdeling Vejle Oligo-array introduceres 2x100.000 prober pr. patient Det humane genom publiceres 2011 2010 2009 2003 2008 2007 SNP-array introduceres 300.000 unikke prober pr. patient Opstart BAC-array 2x4500 prober pr. patient

4. Illumina HiScanSQ maskinen kan både udføre Next-Gen. Sekventering og SNP-array

5. Illumina Human CytoSNP-12 v2.1 Beadchip • 12 patienter pr. Beadchip/kørsel • Input: 200 ng DNA • Fokus på 250 syndrom områder samt 400 sygdomsrelaterede gener • Detektion af deletion, duplikation, loss of heterozygosity, uniparental disomi, nært slægtsskab hos patientens forældre samt mosaikker • Pris 800 kr pr. patient (beadchip + reagenser; ca. 1500 kr inklusiv arbejdstid) • Kan relativt nemt opskaleres til 48 patienter pr. kørsel

6. Bead design • Beadstørrelse 2um • Hver DNA-sekvens består af en adresse kode der identificerer den enkelte bead samt en sekvens der er specifik for et enkelt område på genomet og er lokaliseret til et SNP-site • Hver enkelt bead er coated med ca. 800.00 ens DNA-sekvenser Specifik sekvens Identifier

7. Bead design • Beadstørrelse 2um • Hver DNA-sekvens består af en adresse kode der identificerer den enkelte bead samt en sekvens der er specifik for et enkelt område på genomet og er lokaliseret til et SNP-site • Hver enkelt bead er coated med ca. 800.00 ens DNA-sekvenser

8. Beadchip design

9. Beadchip design

11. 12 billeder pr. subarray 12 subarrays pr. slide 144 billeder totalt (x2) 2,4 cm

12. SNP-array principHvordan bruger vi SNPs til at detektere deletioner og duplikationer i det humane genom?

13. Hvad er en SNP? A C ATTACCGAGAAGGCCGAAG TAAGGCCGAAGAGTTGAGG • SNP står for single nucleotide polymorphism; altså en variation af en enkelt base i det humane genom (fx kromosom 1 basepar position 4256335 der har de fleste et A mens nogle har et C) • Der er SNPs spredt ud over hele det humane genom

14. SNP-array princip Informativ SNP! Person 1 Person 2 Person 3 Person 4 Person 5 Person 6 Person 7 Person 8 Person 9 Person 10 • A og T = A • C og G = B ABBAABABAAABABBBAAABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBABABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBABABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBABABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBAAABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBAAABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBABABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBAAABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBAAABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBABABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBAAABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBAAABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBABABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBABABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBAAABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBABABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBABABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBABABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBAAABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBAAABBBBAAAABBABAAABABBABAAB

15. Sortering af SNPs giver normalt 3 udfaldsgrupper A B B B B B B B B B B B B B BB B BB B B BB BB B B B B B B B B B B B B B BB B BB B B BB BB A B ABA ABABBB AB B AA AB A BA A B A ABA BBA BA A B B A BAB BABAAA BA A BB BA B AB B A B BAB AAB AB B A A AA AA A AAA A A A A A A A A A A A A AA AA A AAA A A A A A A A A A A A A/B B

16. Regioner med deletion har kun 2 udfaldsgrupper A B B B B BB B B BB B BBB B B BB B BB B B BB BB B B B B B B BB B BB B B BB BB A B ABA ABABBB AB B AA A ABA BBA BA A B B A BAB BABAAA BA A BB B BAB AAB AB B A A AA AA AA A AAA A A AA A A A A A A A A A A AA AA A A A A A A A A A/B B

17. Regioner med duplikation har 4 udfaldsgrupper A A B BA AB A ABBAB A BB B B AB BB B BBABA B BA B A BB BA B BABBB B AB AA B B A B A AB A A A A B BA A A B A A A A A A A A A A A A A A A A A A A AA A A A A A A A A A A A A A A A A A A A AA A A A A A A A A A A B A B A B A B A B B BB B BB B BB B B B B B B B B B B B B B B B BB B BB B BB B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B A B A B A B A B A/B B

18. A B A B A B Ved at måle SNP signaler kan vi detektere regioner med hhv. deletion og duplikation Normal Deletion A A B B Duplikation A B A B A A B B

19. SNP-array fremgangsmådeDetektion og kvantificering af A og B SNP signaler

20. SNP-array fremgangsmåde Blodprøvetagning DNA-oprensning Amplifikation Fragmentering Hybridisering

22. Hybridisering G G T C A A

23. G A T C Enkelt-base extension Biotin-labelled ddNTPs Dinitrophenol-labelled ddNTPs C G G C A T G C T A T A

24. Vask C C A G T T

25. Farvning Streptavidin-GREEN Anti-DNP-RED C C A G T T

26. Anti-streptavidin-biotin Forstærkning Anti-Ab-DNP C C A G T T

27. Anti-DNP-RED Streptavidin-GREEN Farvning 2 C C A G T T

28. Scanning

29. A B A B A B Måling af GRØN og RØD signal intensitet for hver enkelt bead C C A G T T

30. 2,6 MB deletion på kromosom 22 22q11.2 deletions syndrom 2,6 MB duplikation på kromosom 22 22q11.2 duplikations syndrom