Instabilit chimique dans les solutions microtubulaires tude et recherche d effecteurs
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Instabilité chimique dans les solutions microtubulaires : étude et recherche d’effecteurs. Thèse préparée au laboratoire du cytosquelette INSERM U366 - CEA Grenoble Sous la direction de Didier Job et Odile Valiron. Plan. Introduction : le cytosquelette microtubulaire. Objectifs.

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Instabilité chimique dans les solutions microtubulaires : étude et recherche d’effecteurs

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Presentation Transcript


Instabilité chimique dans les solutions microtubulaires : étude et recherche d’effecteurs

Thèse préparée au laboratoire du cytosquelette

INSERM U366 - CEA Grenoble

Sous la direction de

Didier Job et Odile Valiron


Plan

  • Introduction : le cytosquelette microtubulaire

  • Objectifs

  • Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules

  • Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules

  • Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules

  • Conclusions et perspectives


Plan

  • Introduction : le cytosquelette microtubulaire

  • Objectifs

  • Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules

  • Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules

  • Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules

  • Conclusions et perspectives


Le cytosquelette microtubulaire

Mitose

Interphase


Structure des microtubules


Assemblage des microtubules

  • Eléments requis :

    • Concentration critique, température minimale

    • Source d’énergie: GTP

    • Solution adéquate (tampon, magnésium)

L’assemblage est réversible, nécessite de l’énergie, atteint un état stationnaire hors d’équilibre


Oligomères

Feuillets

Nucléation des microtubules

DIMERES

MICROTUBULES


Elongation de feuillets

Elongation des microtubules

Addition de dimères


-

+

Instabilité dynamique

Treadmilling

50

Longueur (µm)

30

10

0

2000

4000

Temps (s)

Etat stationnaire

  • Consommation d’énergie à l’état stationnaire

Flux de sous-unités


Mitose

Interphase

Dynamique des microtubulesin vivo

  • Une architecture dynamique

  • Modifications du réseau au cours du cycle cellulaire

  • Renouvellement permanent des microtubules

  • Instabilité dynamique « tempérée »

  • Treadmilling


Contrôle de la stabilité des microtubules

  • Protéines stabilisant les microtubules

    • MAP1, MAP2, Tau, E-MAP115, MAP 4

    • Lis1, Doublecortine

    • XMAP230, XMAP215, TOGp

    • STOP

  • Intégrateurs du cytosquelette

    • Plakines, BPAG1 (microtubules, neurofilaments)

    • MACF (microtubules, actine)

  • Protéines déstabilisantes

    • Stathmine, SCG10

    • XKCM1, Kar3p

    • Rev


Modulation du turnover des microtubules

  • Protéines liant l’extrémité plus des microtubules

    • Bim1, EB1, EB2

    • Tip1p


Plan

  • Introduction : le cytosquelette microtubulaire

  • Objectifs

  • Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules

  • Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules

  • Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules

  • Conclusions et perspectives


Objectifs

  • Réévaluation des facteurs contrôlant la dynamique des microtubules

  • Obtention et caractérisation d’oligomères de tubuline stimulant la nucléation des microtubules

  • Recherche de nouveaux effecteurs de la dynamique des microtubules


Plan

  • Introduction : le cytosquelette microtubulaire

  • Objectifs

  • Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules

  • Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules

  • Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules

  • Conclusions et perspectives


Facteurs contrôlant la dynamique des microtubules

Mise au point de dosages

 Mesure simultanée de

- concentration en tubuline-GTP

- « masse » de tubuline assemblée

- distribution de longueurs des microtubules et longueur moyenne

 [Tubuline-GTP](t)

 m(t)

 l(t)

 [MT](t)

Tubuline complexée au GTP sans excès de GTP

Pas de système régénérateur du GTP

 la tubuline n’assemble qu’une seule fois


  • Vitesse et amplitude augmentent

  • Symétrie des courbes

Réactions d’assemblages

  • Désassemblage en dessous de la concentration critique


Nucléation des microtubules

  • Vitesse de formation de nouveaux microtubules :

  • Indépendante de la concentration instantanée en Tubuline-GTP

  • Fortement dépendante de la concentration initiale en Tubuline-GTP

  • Exposant de nucléation : environ 6,2


Elongation des microtubules

Vitesse d’élongation indépendante de :

- concentration instantanée de tubuline-GTP

- concentration initiale en tubuline-GTP

 Limitée par les propriétés intrinsèques des microtubules ?


Désassemblage des microtubules

Des facteurs de catastrophes

 des oligomères ?

Désassemblage par catastrophes

Indépendant de la longueur


Facteurs contrôlant la dynamique des microtubules

  • Nucléation : un intermédiaire stable entre les dimères de tubuline et les microtubules

  •  Des oligomères de tubuline ?

  • Elongation limitée par les propriétés intrinsèques des microtubules

  •  Fermeture de feuillets

  • Désassemblage limité par la fréquence de catastrophe

  •  Des oligomères facteurs de catastrophes ?


Plan

  • Introduction : le cytosquelette microtubulaire

  • Objectifs

  • Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules

  • Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules

  • Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules

  • Conclusions et perspectives


Recherche d’oligomères de tubuline contrôlant la nucléation des microtubules

  • Production d’assemblages de tubuline stabilisés par pontage covalent

    • Protocole dérivé de méthodes de production « d’amorces » de microtubules : pontage modéré

  • Assemblage de microtubules puis traitement modéré à l ’EGS

  • Collecte des fragments de microtubules stabilisés

  • Filtration éliminant les particules de plus de 100 nm


Caractérisation des solutions d’oligomères de tubuline

  • Les solutions d’oligomères stimulent l’assemblage des microtubules sous la concentration critique

  • Absence de fragments de microtubules dans les solutions

  • - filtration 100 nm

  • - observation en immunofluorescence


Diffusion de lumière

Microscopie électronique

Caractérisation des solutions d’oligomères

  • Uniquement des dimères (env. 8 nm) et des oligomères (env. 42 nm)

  • Des oligomères linéaires


Association latérale

Association longitudinale

Feuillet

Structure des oligomères

  • Liaison de GTP par le dimère de tubuline

  •  échangeable sur la sous-unité b

  • Structures possibles des oligomères


Propriétés de liaison du GTP par les oligomères

Echange du GTP des oligomères contre du GTP radioactif

 Des oligomères formés par association latérale de dimères

Affinité plus faible

Echange plus lent

 contraintes liées au pontage ?


 Exposant de nucléation

Concentration en microtubules

Mécanisme de nucléation des microtubules par les oligomères

Tubuline assemblée

Longueur moyenne des microtubules


Exposant de nucléation

 Environ 4 oligomères sont nécessaires pour former un nouveau microtubule


Caractérisation d’un intermédiaire de nucléation

  • Des oligomères linéaires formés par association latérale de dimères

    • 42 nm  environ 10 dimères

    • Taille + diffusion dynamique de la lumière  65% de tubuline sous forme oligomérique

  • Exposant de nucléation : environ 4

    • 4 oligomères se combinent pour former un microtubule  formation d’un feuillet ?

  • Les microtubules ne désassemblent pas spontanément

    • Absence de facteurs de catastrophes ?


Plan

  • Introduction : le cytosquelette microtubulaire

  • Objectifs

  • Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules

  • Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules

  • Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules

  • Conclusions et perspectives


Stratégie de recherche de partenaires de la tubuline


Partenaires de la tubuline

  • Un nombre limité de partenaires

  • Des partenaires variables selon la nature des extraits


Protéines identifiées

  • MAPs et moteursMAP2, KIF21A

  • Protéines de la famille EBEB1, EB2

  • HSPsHSP70, HSP90

  • Enzymes du métabolismeCitrate lyase


Efficacité de la méthode

  • Identification de protéines liées au cytosquelette microtubulaire

    • Identification toujours en cours

    • Utilisation d’extraits cellulaires humains (séquençage achevé)

    • Grande diversité d’extraits cellulaires possibles

  • Purification de partenaires interférant avec l ’assemblage

    • Exposition des domaines de la tubuline impliqués dans l’assemblage

  • Possibilité de tests fonctionnels en sortie de colonne

    • Identification d’effecteurs de la nucléation, de facteurs de catastrophes


Plan

  • Introduction : le cytosquelette microtubulaire

  • Objectifs

  • Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules

  • Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules

  • Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules

  • Conclusions et perspectives


Conclusions

  • Facteurs contrôlant l’assemblage des microtubules

    • Nucléation en deux étapes (oligomères ?)

    • Elongation limitée par les propriétés structurales des microtubules

    • Désassemblage limité par la fréquence de catastrophes

      • Facteurs de catastrophes = oligomères?

  • Stabilisation et caractérisation d’oligomères de tubuline stimulant la nucléation des microtubules

    • Stabilisation de fragments de microtubules par pontage covalent modéré

    • Oligomères formés par association latérale d’environ 10 dimères

    • Environ 4 oligomères nécessaires pour former un microtubule

  • Identification de partenaires de la tubuline

    • Des partenaires identifiés « qui font sens »

    • Identifications en cours


Perspectives

  • Des outils pour étudier les effecteurs du cytosquelette

    • Mesure de l’activité sur la nucléation, l’élongation, le désassemblage

    • Etude détaillée de la nucléation à partir des oligomères

    • Recherche de facteurs de catastrophes

    • Réalisation d’un  « protéome » des partenaires de la tubuline

  • Transposition aux études cellulaires

    • Effet des oligomères de nucléation dans les cellules


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