Regolamento (CE) N. 2075/2005 Allegato 1

1. Corso teorico-pratico finalizzato allo sviluppo continuo professionaleTrichine nelle carni e controllo ufficialeRegolamento (CE) n. 2075/2005Ravenna 12 Dicembre 2007giuseppe.merialdi@bs.izs.it

2. Regolamento (CE) N. 2075/2005 Allegato 1 METODI DI RILEVAMENTO

3. Altri documenti rilevanti • Commissione Internazionale sulla Trichinellosi (2000) • Raccomandazioni sui metodi per il controllo di Trichinella negli animali domestici e selvatici destinati al consumo umano • European Commision (2001) • Opinion Of the Scientific Committee on Veterinary Measures relating to Pubblic Health on Trichinellosis, epidemiology, methods of dectection an Trichinella-free pig production

4. Altri documenti rilevanti • Laboratorio Comunitario di Referenza per i Parassiti, ISS (2006) • Guideline for the detection of Trichinella larvae at the slaughterhouse or connected laboratory in a Quality Assurance System

5. Campioni • Suino • 1 grammo dal pilastro del diaframma • 2 grammi per scrofe o verri • 2 grammi altri punti diaframma o mascella, lingua, muscoli addominali (4 g per scrofe o verri) • Altri muscoli 5 grammi • Equino • 10 grammi di lingua o massetere

6. Siti di predilezione

7. Metodi di rilevamento • Metodo di riferimento • Metodo dell’agitatore magnetico con digestione artificiale di campioni aggregati • Metodi equivalenti • Digestione artificiale e sedimentazione (Stomacher) • Digestione artificiale e filtraggio • Digestione automatica fino a 35 g (Trichomatic)

8. Metodi di rilevamento • Tutti i metodi di rilevamento (ad eccezione dell’esame trichinoscopico), si basano sullo stesso principio • Digestione cloro-peptica del muscolo • Evidenziazione delle trichine liberate dalla digestione • Variano le tecniche di digestione e di rilevazione

9. 100 grammi (100 campioni di suino o 20 di equino) Digestione cloro-peptica tramite agitatore magnetico Sedimentazione del digerito Osservazione di un sedimento liquido Tempi di esecuzione 1,5/ 2 ore Difficoltà tecnica di esecuzione: bassa Costo attrezzature: basso Costo manutenzioni: basso Impegno di personale: alto Metodo di riferimento: agitatore magnetico (allegato 1, capitolo 1)

10. 100 grammi (100 campioni di suino o 20 di equino) Digestione cloro-peptica tramite stomacher Filtrazione e Sedimentazione accelerata da vibrazioni Osservazione di un sedimento liquido Tempi di esecuzione 1 ora circa Difficoltà tecnica di esecuzione: alta Costo attrezzature: intermedio Costo manutenzioni: intermedio Impegno di personale: alto Metodo equivalente con filtrazione (allegato 1, capitolo 2, B)

11. 35 grammi massimo Digestione e filtrazione automatica Osservazione di un filtro Tempi di esecuzione 15-20 minuti per 35 campioni Difficoltà tecnica di esecuzione: bassa Costo attrezzature: non disponibili nuove attrezzature Costo manutenzioni: elevato Impegno di personale: basso Metodo equivalente con digestione automatica (allegato 1, capitolo 2, C)

12. Esame trichinoscopico(non rientra fra i metodi equivalenti)

13. Metodi di rilevamento • Esame trichinoscopico • Possibile utilizzo transitorio fino al 31/12/2009 per suino o cinghiali • Meno di 15 suini al giorno • Esclusione bollo CEE • Trattamento inattivamente le Trichine

14. Metodi di rilevamento • Esame trichinoscopico: limiti • Permette di osservare solo le Trichine incistate • Non Trichinella pseudospiralis • E’ meno sensibile dei metodi con digestione anche per le forme incistate • Per ogni animale vanno eseguite almeno 56 osservazioni microscopiche (almeno 6 minuti per osservare un un preparato) • Limite massimo 840 osservazioni al giorno pari a 15 suini per operatore

15. Metodi di rilevamento SENSIBILITA’ EFFICIENZA

16. Metodi innovativi • Sono metodi non ufficiali: • Già sviluppati in corso di validazione • In corso di sviluppo • Indiretti: ricerca anticorpi da siero (metodi sierologici) • Diretti: ricerca Trichinella nel muscolo (PCR)

17. Metodo di riferimento PRINCIPI, STRUMENTI, REAGENTI E PROCEDURA

18. Metodo di riferimento: agitatore magnetico • Principio • Comune a tutti i metodi ad eccezione del trichinoscopico • Utilizzo di “un succo gastrico artificiale” (a base di acido cloridrico e tripsina) per digerire il tessuto muscolare • Tempo e temperatura sotto controllo • Le cisti muscolari si rompono e le trichine vengono rilasciate • Concentrazione delle larve per sedimemtazione e loro osservazione microsopica

19. Trichinella incistata nel muscolo Trichinella nel liquido di digestione

20. Metodo di riferimento: agitatore magnetico • Strumentazione molto semplice • Bilancia (digit 0,1) • Sminuzzatore tipo Moulinex o Minipimer • Termometro a mercurio o a sonda • Agitatore termoriscaldato • Imbuti, cilindri, supporti, pipette, piastre Petri • Steromicroscopio • Costo del laboratorio: 2000 € circa

21. Metodo di riferimento: agitatore magnetico • Reagenti • Pepsina 1: 10.000 NF corrispondente a 1:12 500 BP • Pepsina : 1 Kg costa 500 €, ogni pool da 100 g sono 5 € • Conservare in luogo fresco asciutto • Mantenere etichetattura • Possibile utilizzare formula liquida 660 EP unità/ml • Acido Cloridrico 25% • A partire dal comunemente reperibile 37% applicare la proporzione • 37:100=25:X • Aggiungere lentamente 67,5 ml di HCl 37% a 32,43 ml di acqua distillata

22. Metodo di riferimento: agitatore magnetico • FASE 1: preparazione aggregato • Suino 100 campioni da 1 g • Equino 20 campioni da 5 g • E’ possibile aggiungere 15 grammi ad una serie completa (15 suini e 3 equini) • Se l’aggregato inferiore o uguale a 50 grammi si utilizzerà metà del liquido di digestione • Utilizzo della bilancia

23. Metodo di riferimento: agitatore magnetico • FASE 2: sminuzzamento

24. Metodo di riferimento: agitatore magnetico • FASE 3: Preparazione liquido di digestione • Preparare 2 litri di acqua preriscaldata a 46-48°C • Aggiungere 16 ml di HCl 25% • Introdurre barra di agitazione • Aggiungere 10 g di pepsina • Se aggregato ≤ 50 grammi dimezzare tutto

25. Metodo di riferimento: agitatore magnetico • FASE 4: digestione • Trasferire nel becher la carne sminuzzata • L’agitatore magnetico deve mantenere il agitazione a temperatura controllata • Controllare con termometro 44-46°C • Tempo di digestione 30 minuti salvo eccezioni

27. Metodo di riferimento: agitatore magnetico • FASE 5. sedimentazione • Trasferimento tramite setaccio in imbuto separatore per sedimentazione (30 minuti) • Raccolta di 40 ml di liquido • Sedimentazione per 10 minuti • 10 ml di sedimento + 10 ml di acqua

31. Metodo di riferimento: agitatore magnetico • FASE 6 : Osservazione microscopica • Stereomicroscopio 15/20 ingrandimenti • Sospetti 60-100 ingrandimenti (microscopio ottico)

33. Metodo di riferimento PUNTI DI CONTROLLO CRITICO (CCP) E REQUISITI

34. Digestione in pool: punti di controllo critico • CCP 1: Identificazione dei campioni • Numero dei campioni uguale al numero dei suini analizzati • Possibilità di risalire ai suini di provenienza

35. Metodo di riferimento: agitatore magnetico • CCP1 • Garantire la tracciabilità fra campione e carcassa o partita di carcasse • Predisporre un foglio di lavoro in cui siano riportate le informazioni necessarie • Data • Identificazione partite/animali • Operatore ha eseguito la prova (firma) • Operatore ha eseguito la prova (firma) • Operatore che legge l’analisi (firma) • Registrazione lotti reagenti • Risultati

37. Lotto pepsina: Lotto HCl:

38. Digestione in pool: punti di controllo critico • CCP 2: Qualità del liquido digestivo • Giusto rapporto tra liquido digestivo e quantità di tessuto • Misurazioni di pepsina e acido cloridrico • ATTENZIONE: Non miscelare mai direttamente pepsina e acido cloridrico!

39. Digestione in pool: punti di controllo critico • CCP 3: Temperatura di digestione (44-46°C) • Se superiore: inattivazione della pepsina, incompleta digestione • Se inferiore: tempi di digestione più lunghi, incompleta digestione • Requisito: taratura del termometro

40. Digestione in pool: punti di controllo critico • CCP 4: Efficacia della digestione • Controllare il materiale che rimane nel setaccio • Se connettivo: campioni non ottimali • Se muscolo indigerito: digestione inefficace

42. Digestione in pool: punti di controllo critico • CCP 5: Tempo di sedimentazione • Almeno 30 minuti • Utlizzare contaminuti con allarme sonoro

43. Digestione in pool: punti di controllo critico • CCP 6: Sufficiente chiarificazione • Possibile lettura di piccoli caratteri a stampa attraverso la Piastra Petri contenente il liquido • Ripetere l’ultimo passaggio di sedimentazione aggiungendo acqua di rubinetto

45. Digestione in pool: punti di controllo critico • CCP 7: Stereomicroscopio • Ingrandimenti sufficienti (15- 20 meglio fino a 40) • Pulizia • Manutenzione annuale da ditta esterna

46. Metodo di riferimento REQUISITI STRUTTURALI

47. Requisiti strutturali • Sorgenti di energia elettrica • Lavabo con collegamento rete idrica • Approvvigionamento acqua • Lavaggio vetreria • Illuminazione idonea • Spazio sufficiente • Lavastoviglie (utile ma non necessario)

48. Metodo di riferimento REQUISITI DI PERSONALE

49. Regolamento (CE) n. 2075/2005 • Tutto il personale che partecipa all’esame dei campioni deve essere adeguatamente formato • Programma di controllo delle qualità delle analisi • Analisi regolare delle procedure di valutazione, registrazione ed analisi

50. Sicurezza in laboratorio Pericolo Biologico (Trichinella) • Rischio quasi trascurabile • Dose infettante 100/300 larve vitali • Malattia mai dimostrata in seguito a infestazioni in laboratorio • Misure precauzionali di base • Camice • Guanti • Non mangiare, bere, fumare durante esecuzione analisi • Non pipettare con la bocca