Planung von Experimenten zur Sicherheitsforschung bei Gehölzen

1. Planung von Experimenten zur Sicherheitsforschung bei Gehölzen W. E. Weber Institut für Pflanzenzüchtung und Pflanzenschutz Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Dahnsdorf, 5. Juni 2003

2. Gliederung • Struktur des Forschungsverbundes Gehölze • Projektübergreifende Aspekte • Unterbindung des vertikalen Genflusses bei Pappel und Apfel • Vertikaler Genfluss bei Rosen • Entgiftung und horizontaler Genfluss bei Pappeln • Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein

3. Struktur des Forschungsverbundes Spezifische Umweltwirkungen transgener Gehölze Vertikaler Rhizosphäre Rebarthropoden Gentransfer Sterilitätskonzepte Rebarthropoden Rhizosphäre P1: Espe P4, P5: Pappel P6: Rebe P2: Apfel Auskreuzung P3: Rose Verantwortliche, am Vorsorgeprinzip orientierte Nutzung gentechnisch veränderter Gehölze

4. Gehölze, Übersicht über die Projekte • P1 Espen und P2 Apfel • Männliche und weibliche Sterilität bzw. Parthenokarpie sollen vertikalen Gentransfer unterdrücken. • P3 Rosen • Quantitative Erfassung des vertikalen Gentransfers • P4 Pappeln • Bodensanierung durch transgene Pappeln • P5 Pappeln • Einfluss von Transgenen auf die Rhizoflora im Labor und Freiland • P6 Wein • Direkter und indirekter Effekt von Chitinasen und anderen Enzymen auf Rebarthropoden bei Wein

5. Gliederung • Struktur des Forschungsverbundes Gehölze • Projektübergreifende Aspekte • Unterbindung des vertikalen Genflusses bei Pappel und Apfel • Vertikaler Genfluss bei Rosen • Entgiftung und horizontaler Genfluss bei Pappeln • Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein

6. Gehölze sind durch folgende Besonderheiten gekennzeichnet: • mehr- bis vieljährig • große Pflanzen • langsame Jugendentwicklung bis zur Blüte • genetisch vergleichsweise wenig untersucht

7. Generelle Aspekte mit transgenen Gehölzen • Der Versuchsansteller ist für viele Jahre standortmäßig festgelegt. • Es gibt zahlreiche Wechselbeziehungen zur übrigen Flora und Fauna. • Nur eine vergleichsweise kleine Zahl an Pflanzen kann genauer untersucht werden. • Ein einmal gewählter Versuchsplan ist kaum noch zu ändern. • Partielle Entnahme von Bäumen führt zu Lücken im Versuchsplan mit allen Konsequenzen.

8. Gliederung • Struktur des Forschungsverbundes Gehölze • Projektübergreifende Aspekte • Unterbindung des vertikalen Genflusses bei Espen und Apfel • Vertikaler Genfluss bei Rosen • Entgiftung und horizontaler Genfluss bei Pappeln • Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein

9. P1 Espe - Ziele • Vermeidung von Auskreuzungen bei transgenen Espen • männliche Sterilität => Pollenflug aus der Anlage • weibliche Sterilität => Samenbildung in der Anlage • Zur Vermeidung eines vertikalen Transfers wird beides gebraucht. • Bei nur partieller Unterdrückung: quantitative Erfassung • Prozentsatz falscher Blüten Quantitative Ausprägung würde im Ernstfall aber kritisch zu bewerten sein.

10. P1 Espe • Projektplan • 7 Konstrukte (Agrobacterium tumefaciens vermittelt) und Kontrolle • Jeweils zwei Varianten: ohne und mit rolC-Gen Das rolC-Gen verursacht eine gut erkennbare Wuchsveränderung. • Jeweils 2 Varianten: ohne und mit Konstrukt für Frühblühen • Je Variante 10 transgene Bäume geplant

11. rolC- Gen • geringer Wuchs (B) hellgrüne Blattfarbe • Eigenschaften rolC-transgener Aspen (links, mitte) • im Vergleich zu nicht transformierten Pflanzen (rechts).

12. P1 Espe • Versuchsumfang • (7 +1) * 2 * 2 = 32 Varianten = 320 Bäume • Kontrolle der transgenen Espen mit PCR • Einbau nur eines Konstrukteswichtig, da mehrere Konstrukte sich gegenseitig beeinflussen könnten • Ermittlung des Insertionsortes • Anzucht der Bäume bis zur Blüte • Beobachtung über mehrere Perioden

13. Promotor/Zielgen-Kombination Zielgewebe der Expression Verfügbarkeit PTA29-Barnase Tapetum Dr. Debener PTA 29-Vst1 Tapetum Dr. Debener ClGPDHC- Barnase Pollen Dr. Debener ClGPDHC-Vst1 Pollen Dr. Debener PTA29-argE Tapetum Prof. I. Broer Stigma-spez. Promotor-Barnase Stigma Dr. Debener DefH9-iaaM Stigma Prof. A. Spena Konstrukte

14. P1 Espe • Versuchsfragen: • Zeigen die Konstrukte die gewünschte Wirkung? • Ist die Wirkung ausreichend? • Vergleiche: • Jeweils mit gegen ohne Konstrukt, sowohl mit als auch ohne rolC-Gen (Einfach- gegen Doppeltransformation) • Verschiedene Konstrukte miteinander

15. P1 Espe – Offene Fragen • Es ist unbekannt, wann und wie intensiv die Espen blühen, es besteht aber die Hoffnung, dass dies in 1-3 Jahren realisierbar ist. • Es ist unbekannt, ob die Konstrukte zu ausreichender männlicher oder weiblicher Sterilität führen. • Es darf zur Erreichung des Zieles nur ein kleiner Teil falscher Blüten gebildet werden. Wer setzt fest , welcher Anteil tolerierbar ist (etwa 5%) ?

16. P1 Espe - Sicherheitsaspekte • Wenn die Espen blühen und der Mechanismus nicht mit Sicherheit erfolgt, könnte eine Ausbreitung stattfinden. • Dem kann im Projekt dadurch vorgebeugt werden, dass die blühenden Bäume ins Gewächshaus gebracht werden. • Nach Ablauf des Versuches wird die Fläche vollständig gerodet.

17. P1 Espe – biometrische Aspekte (1) • Vergleich der Konstrukte mit Kontrollen • Alle Konstrukte werden mit derselben Kontrolle verglichen. • Zusätzlich interessiert der Vergleich der Kontrollen untereinander. • Stichprobenumfang • kein Problem, da viele Blüten vorhanden • Zeitabhängigkeit • Effekt unbekannt • Blüte auch in Folgejahren, aber im Projektzeitraum wohl nicht mehr verfügbar

18. P1 Espe – biometrische Aspekte (2) Quantitative Erfassung der Wirkung • Idealfall: 100 %, jeder Abweicher widerlegt die Hypothese • Realfall: vorgegebene Frequenz an Abweichern • Ist die Frequenz genotypabhängig? • Welche Verteilung liegt vor (binomial, Poisson, geklumpt) ? • Wie ist die Frequenz zu bewerten?

19. P2 Apfel - Ziele • Übertragung von Resistenzen über Transformation • Feuerbrand • Apfelschorf • Apfelmehltau • Verhinderung der Auskreuzung transgener Bäume • männliche Sterilität => kein Pollenflug aus der Anlage • Parthenokarpie => samenlose Früchte • Bei nur partieller Unterdrückung: quantitative Erfassung • Prozentsatz falscher Blüten

20. P2 Apfel Projektplan • 6 Konstrukte (Agrobacterium tumefaciens vermittelt) und Kontrolle • Transformation transgener und nicht transgener Linien der Sorte ‚Pinova‘ in vitro • Kontrolle der Transformation • PCR, Southern Blot, ELISA, ... • Veredlung auf M9 mit ‚Hibernal‘ als Zwischenveredlung

21. P2 Apfel - Konstrukte

22. P2 Apfel – biometrische Aspekte • Vergleich der Konstrukte mit Kontrollen • Alle Konstrukte werden mit derselben Kontrolle verglichen. • Zusätzlich interessiert der Vergleich der Kontrollen untereinander. • Vergleich transgen gegen nicht transgen • Andere Aspekte ähnlich wie bei den Espen (P1)

23. Gliederung • Struktur des Forschungsverbundes Gehölze • Projektübergreifende Aspekte • Unterbindung des vertikalen Genflusses bei Pappel und Apfel • Vertikaler Genfluss bei Rosen • Entgiftung und horizontaler Genfluss bei Pappeln • Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein

24. P3 Rosen - Teilprojekt 1 • Auskreuzungsrate bestimmter Rosentypen • Floribundarosen (‚Heckenzauber‘) • Teehybriden (‚Pariser Charme‘) • Erfassung der Polleneintragsrate über selbstinkompatible Fängerpflanzen (diploider Genotyp) in Abhängigkeit von • Abstand: 0, 20 und 200 m • Richtungen: 2-3 • Standorte: Ahrensburg, Groß Lüsewitz • Überprüfung der Auskreuzungsrate • an Samen • mittels molekularer Marker

25. P3 Rosen - Teilprojekt 1 (Versuchsplan) Versuchskern: 5 Pariser Charm 5 Heckenzauber F F F PC F F Heck F 20 200 Mantel: 20 Fängerpflanzen in 20 bzw. 200 m Entfernung: je 5 Fängerpflanzen 20 F Merkmale: Zahl der Früchte zu Zahl der Blüten Je Fängerblock max. 20 Samen 200 F

26. P3 Rosen - Teilprojekt 1 (Auswertung) • Früchte pro Blüte Heckenzauber und Pariser Charme als Kontrollen für die selbstinkompatiblen Fängerpflanzen • Vergleich von Anteilen; 2 Orte • Samenkeimrate bei Fängerpflanzen • mehrdimensionale Kontingenztafel • Orte, Abstände, Richtungen • Herkunft von Samen bei Fängerpflanzen • mehrdimensionale Kontingenztafel • Orte, Abstände, Richtungen sowie Genotypen (Heckenzauber‚ Pariser Charme, andere Quellen)

27. P3 Rosen - Teilprojekt 2 • Auskreuzungsrate aus Kulturrosen in Wildrosen • Quelle: 2 Rosenzuchtbetriebe • Empfänger: natürlich vorkommende Wildrosen in der Umgebung • Versuchsplan • Anzahl Wildrosen unbekannt, daher kein Plan möglich • max. 100 Samen pro gefundener Pflanze • max. 1000 Samen • Auswertung • Anteil Samen auf Wildrosen aus Auskreuzung • Identifizierung über molekulare Marker

28. Gliederung • Struktur des Forschungsverbundes Gehölze • Projektübergreifende Aspekte • Unterbindung des vertikalen Genflusses bei Pappel und Apfel • Vertikaler Genfluss bei Rosen • Entgiftung und horizontaler Genfluss bei Pappeln • Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein

29. P4 und P5 Pappeln: Ziele Projektplan • Freisetzung transgener Pappeln mit dem Ziel derSchwermetallaufnahme zur Entgiftung verseuchter Böden. Hintergrund ist die Überexpression cytosolischer -Glutamylcystein-Synthetase (cyt-ECS) transgener Pappeln. • Stabilität des Transgens über mehrere Perioden • Erfassung des horizontalen Gentransfers über Mykorrhizen

30. P4 Pappeln • Versuchsumfang • 2 Standorte (Mansfelder Land, Ekatarinenburg) • 3 Belastungsgrade mit Kupfer • transgene Pappeln und Kontrollen randomisiert in 50*50 m² Parzellen • Beobachtungszeitraum • 3 Jahre (geplant), jedes Jahr werden einige Bäume zur Untersuchung gerodet und ergeben Lücken. • Vergleiche • zwischen Kontrollbäumen und transgenen Bäumen • zwischen Kupferbelastungen • für jeden Standort getrennt

31. Mansfelder Land Ekatarinenburg P4 Pappeln - Versuchsplan geringe Kupferbelastung mittlere Kupferbelastung ( ) keine Fläche gefunden hohe Kupferbelastung

32. 17 25 19 15 11 10 13 8 18 21 35 24 26 1 36 14 3 31 12 6 7 30 2 29 33 28 34 32 9 27 20 16 23 22 5 4 P4 Pappeln – Versuchsplan (Detail) Ausschnitt; schwarz = Kontrolle, rot = transgen Insgesamt 144 = 72+72 Bäume + 2 Reihen Kontrolle als Mantel

33. P4 Pappeln – Analyse des Entgiftungsprozesses (1) • Zu Beginn des Versuches • Bodenproben an verschiedenen Stellen • Während der Vegetation • 3 Probenahmetermine im Abstand von 2 Monaten • Messung der Konzentration an Thiolen (Glutathion und Phytochelatine) in den Blättern (HPLC) • Messung der Expression des gshl Gens (Northern Blot)

34. P4 Pappeln – Analyse des Entgiftungsprozesses (2) • Am Ende der Vegetation jedes Jahr • Rodung von 10 Kontroll- und 10 transgenen Bäumen je Parzelle • Chemische Analyse der Biomasse (in Blätter und Holzteile getrennt) auf 10 Schwermetalle • Bodenproben an den Entnahmestellen • Sammeln der Blätter nach Laubfall (vermeidet Wiedereintrag) • Am Ende des Versuches • Rodung der Flächen • Verbrennung und Ascheanalyse auf Schwermetalle • Bodenproben an verschiedenen Stellen

35. P5 Pappeln und Mykorrhizen Schwerpunkte sind: • Untersuchung des Einflusses der verstärkten Schwefelaufnahme durch transgene Pappeln auf die Zusammensetzung der für Pappeln wichtigen Mykorrhizen • Beeinflussung der Schwefelaufnahme transgener Pappeln durch Mykorrhiza • Untersuchungen zum horizontalen Gentransfer (Übertragung von Transgenen von der Pappel auf Mykorrhizen). Hierzu dient der Versuch zur Bodenentgiftung (P4).

36. P4 und P5 Pappeln –Mykorrhiza • Mykorrhizisierungsgrad an Stichproben (20 +30+30 Bäume) • Anzucht der gefundenen Mykorrhizen und deren Bestimmung der Arten • Verschiedene Entnahmezeitpunkte, um Umwelteinflüsse zu erfassen • Da horizontaler Gentransfer ausgesprochen selten erwartet wird, ist eine biometrische Analyse kaum möglich.

37. Gliederung • Struktur des Forschungsverbundes Gehölze • Projektübergreifende Aspekte • Unterbindung des vertikalen Genflusses bei Pappel und Apfel • Vertikaler Genfluss bei Rosen • Entgiftung und horizontaler Genfluss bei Pappeln • Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein

38. P6 Wein – Auswirkung transgener Reben auf Arthropoden als Nichtzielorganismen • A: Laborversuche zum Einfluss von Enzymen und Insektenpathogenen auf Larven von Lobesia botrana (Traubenwickler, Schädling) und Typhlodromus pyri (Raubmilbe, Nützling) • B: Gewächshausversuche mit transgenen Reben, die diese Enzyme enthalten • C: Freisetzungsversuche mit transgenen Reben

39. P6 Wein – Auswirkung transgener Reben auf Arthropoden als Nichtzielorganismen • Enzyme • CHI (Chitinase) • GLU (1,3 Glucanase) • RIP (Ribosom-inhibierendes Protein) • Insektenpathogene • Bacillus thuringiensis • Entomopathogene Pilze • Erfasste Wirkungen • Direkte Toxizität der Enzyme • Synergistische und antagonistische Wirkungen der Enzyme über die Insektenpathogene

40. P6 Wein – Biometrische Aspekte • Toxizität über Probitanalyse • LD50 sowie LD20 und LD80 • Schwellenwerte über Vorversuche • Mikroskopische Untersuchungen • Beschaffenheit der Matrix des Mitteldarmes wird an 10 Larven je Stufe analysiert • Sequentielle Vorgehensweise • Das Ergebnis der Laborversuche bestimmt das Vorgehen im Gewächshaus, dieses wiederum die Strategie bei den Freilandversuchen

41. Zusammenfassung • Der Verbund ist vergleichsweise heterogen. • Die Dauerhaftigkeit der Gehölze verträgt sich schlecht mit der zeitlich befristeten Projektdauer. • Die Möglichkeiten der biometrischen Versuchsplanung sind bei Freilandversuchen und z. T. auch im Gewächshaus stark eingeschränkt. • Einige Ereignisse werden nur selten erwartet, der für sichere Aussagen notwendige große Stichprobenumfang ist aber technisch meistes nicht machbar. • Im Vordergrund steht der Erkenntnisgewinn, nicht die Sicherheit.