MATERIALE DEL CORSO

1. MATERIALE DEL CORSO http://linux.btbs.unimib.it

2. ALLINEAMENTO DI SEQUENZA • PER ESEGUIRE UN ALLINEAMENTO DI SEQUENZA SONO NECESSARI ESSENZIALMENTE 3 STRUMENTI: • Avere a disposizione unaMATRICE DI SOSTITUZIONE. La matrice definisce la il GRADO di SIMILARITA’ tra amminoacidi; • Avere a disposizione unALGORITMO DI ALLINEAMENTO cercando di massimizzare il punteggio dato dalla matrice e valutando quanti gap (interruzioni) inserire; • Avere a disposizione per evitare allineamenti senza senso una PENALITA’ per l’introduzione dei GAP. I GAP riflettono inserzioni/delezioni avvenute durante l’evoluzione LLTTVRNN LLTTVRNN LLVRNN LL--VRNN

3. SIMILARITA’ DI SEQUENZA • Nel punteggio di similarità di sequenza si tiene conto del fatto che gli amminoacidi a confronto in ogni posizione siano simili, differenti o identici e di una penalità per i gap. • PER DEFINIRE LA SIMILARITA’ TRA LE DUE SEQUENZE SI USANO MATRICI BASATE SU PRESUPPOSTI DIVERSI: • identità/non identità; • Caratteristiche chimico-fisiche degli aa; • Basate sul codice genetico: valutare quante mutazioni fare in una tripletta per passare da un aa a un altro. (se ad es. si cambia un solo nucleotide la sostituzione la sostituzione sarà meno penalizzata perché si tratta di evento probabile nel corso dell’evoluzione) • Basate sucriteri evolutiviestrapolati da confronto di sequenze di proteine omologhe (MATRICI BLOSUM E PAM) 2 penalità per i gap (apertura (fisso), estensione (lunghezza dipendente))

4. L’utilizzo della matrice di similarita’ appropriata per ciascuna analisi e’ cruciale per avere buoni risultati.Infatti relazioni importanti da un punto di vista biologico possono essere indicate da anche molto debole similarità. Sequenze poco divergenti   molto divergenti BLOSUM80 BLOSUM62BLOSUM45 PAM1 PAM120PAM250

5. Penalizzazioni degli indels • Generalmente si usano funzioni del tipo “lineare” wx = gx • o, più frequentemente, di tipo “affine” wx = g + rx oppure wx = g + r(x—1) dove g è il punteggio di penalizzazione per l’apertura, r per l’elongazione e x la lunghezza dell’indel

6. Gap • 2 sequenze biologiche possono differire tra loro non solo per sostituzione di un residuo con un altro ma anche per inserzione o delezione di residui. • E’ quindi spesso necessario introdurre degli spazi “-” in una o in entrambe le sequenze da allineare, anche al fine di portare le sequenze alla stessa lunghezza. • Una sequenza di spazi contigui si definisce gap. • Necessario determinare un criterio per l’inserimento di tali gap. • L’inserimento di un gap abbassa lo score dell’allineamento; in questo modo, essendo il nostro scopo quello di massimizzare lo score dell’allineamento, verranno inseriti gap solo quando ciò è strettamente necessario.

7. Penalità associate ai GAP • La maggior parte degli algoritmi di allineamento usano penalità associate ai gap, diverse per apertura ed estensione. • IL GOP (Gap Opening Penalty) è la penalità da pagare ogni qual volta viene inserito un gap • IL GEP (Gap Extension Penalty) è la penalità da pagare ogni qual volta viene esteso un gap già esistente. • Di solito GOP> GEP cioè aprire un nuovo gap è più costoso che estenderne uno essitente. In questo modo si tende ad avere inserzioni e delezioni di parecchi residui per volta piuttosto che inserzioni e delezioni sparse GOP GEP

8. ALLINEAMENTO DI SEQUENZE A COPPIE AGTTTGAATGTTTTGTGTGAAAGGAGTATACCATGAGATGAGATGACCACCAATCATTTC ||||||||||||||||||| |||||||| ||| | |||||| ||||||||||||||||| AGTTTGAATGTTTTGTGTGTGAGGAGTATTCCAAGGGATGAGTTGACCACCAATCATTTC MULTIPLO KFKHHLKEHLRIHSGEKPFECPNCKKRFSHSGSYSSHMSSKKCISLILVNGRNRALLKTl KYKHHLKEHLRIHSGEKPYECPNCKKRFSHSGSYSSHISSKKCIGLISVNGRMRNNIKT- KFKHHLKEHVRIHSGEKPFGCDNCGKRFSHSGSFSSHMTSKKCISMGLKLNNNRALLKRl KFKHHLKEHIRIHSGEKPFECQQCHKRFSHSGSYSSHMSSKKCV---------------- KYKHHLKEHLRIHSGEKPYECPNCKKRFSHSGSYSSHISSKKCISLIPVNGRPRTGLKTs

9. Algoritmi per allineamento a coppie • Costruire tutti i possibili allineamenti e selezionare quello con score più alto? • NO! Impraticabile anche solo per corte sequenze di 20 aa ALLINEAMENTO MEDIANTE PROGRAMMAZIONE DINAMICA Date due stringhe S e T, con |S|=n e |T|=m, il nostro obiettivo è il calcolo dell’allineamento ottimale di S e T. Gli algoritmi di programmazione dinamica vengono utilizzati nella risoluzione di problemi di ottimizzazione; nel nostro caso ci interessa massimizzare lo score dell’allineamento. Un algoritmo di programmazione dinamica trova la soluzione migliore spezzando il problema originale in sottoproblemi più semplici da risolvere. La soluzione di ogni sottoproblema si basa sulle soluzioni dei sottoproblemi già risolti. Variazioni dell’algoritmo producono allineamenti globali o locali

11. Metodo della matrice a punti (Dot matrix) • proposto da Gibbs and McIntyre (1970) • sistema di visualizzazione di un allineamento • consente di evidenziare ripetizioni dirette o inverse nelle sequenze • il maggiore vantaggio di questa tecnica consiste nel dare tutte le possibili corrispondenze di simboli tra due sequenze • esempi di programmi che lo codificano: • COMPARE eDOTPLOTnel pacchetto GCG • DOTLET

12. Metodo della matrice a punti (Dot matrix) • Il dot-plot è una semplice rappresentazione grafica della similarità di 2 sequenze • In ogni posizione in cui nelle 2 sequenze si trovano nucleotidi identici/simili viene segnato un punto (dot) • Le regioni di similarità tra due sequenze danno una diagonale • I gapsappaiono come salti in diagonale e le regioni ripetute come segmenti diagonali paralleli

13. È possibile utilizzare dei filtri per diminuire rumore di fondo ed evidenziare le similarità. Per es. il puntino viene segnato solo quando, in una finestra di quattro basi/amminoacidi, almeno tre sono identiche • Quindi per riconoscere le similarità in sequenze lontane evolutivamente occorre ampliare la finestra • Il limite della dot matrix è data dal fatto che non dà un valore all’allineamento , è solo una rappresentazione grafica

14. Sequenze/Domini ripetuti • Es. seq proteica contro se stessa. In cui evidenziate le seq corrispondenti ai due domini della proteina – diversi domini ripetuti – nel dominio A 4 regioni ripetute fatte a loro volta da piccole sequenze di aa ripetuti (leu-rich)

15. Rappresentazione DOT-PLOT m a r g a r e t q a k l e r d a y h q f f * m * * * * a * * r * g * * * * a * * Duplicazione r * * e * t * Inversione d * * * a * y * h * q * f * Similarità f Diagonali = individuano regioni di similarità nelle 2 proteine (tra sottosequenze) Qualunque allineamento delle 2 seq. Può essere rappresentato come una spezzata che parte dall’angolo in alto a sin. e raggiunge quello in basso a destra. *

17. Allineamento GLOBALE o LOCALE GLOBALE quando prova a cercare la corrispondenza ottimale tra tutti gli amminoacidi di entrambe le sequenze. LOCALE quando cerca di individuare regioni locali di similarità. È biologicamente rilevante perchè ad es. potrebbe permetterci di individuare domini correlati in proteine in cui le altre porzioni della seq. non hanno relazioni evolutive. Ricerca di omologhi in un una banca dati (molte proteine non correlate). Global alignment LTGARDWEDIPLWTDWDIEQESDFKTRAFGTANCHK ||.  | |  |  .|     .|  ||  || | ||   TGIPLWTDWDLEQESDNSCNTDHYTREWGTMNAHKAG Local alignment     IPLWTDWDIEQES             ||||||||.||||            IPLWTDWDLEQES

19. ALLINEAMENTO MEDIANTE PROGRAMMAZIONE DINAMICA • Il primo algoritmo è stato sviluppato da Needleman e Wunsch nel 1970 per l’individuazione di similarità globali in un tempo proporzionale al prodotto delle lunghezze delle due sequenze • Nel 1981 Smith e Waterman hanno sviluppato un algoritmo per il riconoscimento delle similarità locali • L’algoritmo si svolge in 3 fasi: • Realizzazione di una dot matrix, nelle cui caselle si mettono i valori ottenuti da una matrice di sostituzione, normalizzata in modo da avere solo score positivi • Si cerca il percorso tra le caselle che totalizza il punteggio massimo, tenendo conto solo di alcune direzioni permesse nella deconvoluzione dell’allineamento • Si cerca la casella con il punteggio massimo e si procede a ritroso per ricavare i singoli appaiamenti

20. Algoritmo di Smith & Waterman (1981) • È un metodo di allineamento locale • Si deve includere una soglia al di sotto della quale l’appaiamento di 2 aa sia da considerare negativo • Il sistema di punteggio deve includere valori negativi per amminoacidi diversi (matrici PAM o BLOSUM) • Il concetto di locale implica che il punteggio non deve essere influenzato dalle regioni esterne all’allineamento • quando i 3 percorsi di origine saranno negativi, allora viene scelto lo 0 come valore (cioè l’inizio di un nuovo allineamento) • l’allineamento viene prodotto a partire dalla casella che contiene il valore massimo attraverso un retropercorso che si ferma ad una casella con valore 0 • Per trovare il punteggio massimo non ci si limita all’ultima riga o all’ultima colonna • Si cercano tutti gli allineamenti locali che indipendentemente raggiungono un punteggio superiore a una certa soglia

21. ALLINEAMENTI MULTIPLI • Gli allineamenti multipli vengono utilizzati per: • Trovare motivi/domini conservati che caratterizzano le famiglie di proteine • Riconoscere omologia tra una nuova sequenza e una famiglia di proteine • Nella predizione della strutturasecondaria e terziaria di nuove proteine • Riconoscere relazioni filogenetiche (come strumento nell’analisi evoluzionistica molecolare) Un allineamento multiplo delle sequenze S1, S2,….Sn è una serie di sequenze S1’, S2’, Sn’ contenenti gaps, tali per cui: Tutte le sequenze S’ sono di uguale lunghezza Sj’ è un’estensione di Sj ottenuta mediante inserimento di gap Rappresentato sotto forma di tabella in cui righe sono le seq e colonne corrispondenti a ciascun sito dell’allineamento

22. Un allineamento multiplo contiene più informazioni di un allineamento coppie

23. ALLINEAMENTI MULTIPLI L’allineamento multiplo è un’ipotesi di omologia posizionale tra basi o aminoacidi Tutti i residui presenti nella stessa colonna di un multiallineamento sono evolutivamente correlati No applicabili algoritmi di allineamento globale esatto (cresce esponenzialmente con il numero di sequenze da allineare es. N seq lunghezza L -> O(LN) Teoricamente sarebbe possibile applicare l’algoritmo di Needleman e Wunsch, ma in pratica non lo è perché richiede tempi di esecuzione troppo lunghi METODI APPROSSIMATI

24. ALLINEAMENTO PROGRESSIVO • Basato su costruzione di una successione di allineamenti a coppie • Dato un insieme S costituito da n sequenze da allineare, si scelgono due sequenze s1 e s2 e si allineano; questo allineamento resta fissato nei passi successivi • Si sceglie una terza sequenza s3 e si allinea al precedente allineamento, e così via • E’ un approccio euristico e non garantisce di trovare allineamento multiplo ottimale ma efficiente e dà risultati ragionevoli • Prevedono che coppie di sequenze che presentano un maggior grado di similarità tra loro siano allineate per prime (giustificato dal fatto che coppie di seq + simili avranno maggiore probabilità di essere derivate + recentemente da un antenato comune e il loro allineamento fornisce informazioni più affidabili - le posizioni dei gap in seq maggiormente correlate sono tipicamente + accurate rispetto a quelle relative a seq meno simili, per cui i gap degli allineamenti iniziali vanno preservati durante l’allineamento progressivo)

25. ClustalW • ClustalW è il programma + popolare per gli allineamenti multipli di biosequenze • Dato un insieme S di n sequenze da allineare, ClustalW allinea tutte le coppie di sequenze di S separatamente e costruisce una matrice con le distanze tra ogni coppia di sequenze, che esprime il grado di divergenza di ciascuna coppia di sequenze

26. AB A B ClustalW • Viene calcolato un albero guida a partire dalla matrice di distanza. Sequenze con elevato grado di similarità si trovano vicine nell’albero e viceversa (metodo neighbour-joining) • Le sequenze sono progressivamente allineate secondo un ordine di similarità, dedotto dall’albero guida • Si sceglie la coppia + vicina che formerà il primo “sotto-albero”

27. ClustalW Sostituiamo nella tabella la entry AB alle singole entry A e B e calcoliamo le distanze di AB dalle sequenze rimanenti facendo una semplice media aritmetica: d (AB,C)= (d(A,C) + d(B,C))/2 = 0.375 D (AB, D) = (d(A,D)+d(B,D))/2 = 0.175 ? 0.375 ? 0.57 0.175 Iterando il procedimento si ottiene l’albero completo.

28. A B D C ClustalW • Otterremo un albero i cui rami hanno lunghezza proporzionale alla distanza tra le sequenze : • Quest’albero verrà utilizzato per guidare l’allineamento progressivo. • Nel nostro esempio verranno allineate per prime le sequenze A e B. Successivamente verrà allineata la sequenza D all’allineamento AB e infine verrà allineata la sequenza C all’allineamento ABD.

29. Allineamento con ClustalW • La presenza di un simbolo * in fondo ad una colonna indica un match del 100%. • Il simbolo :indica un’alta similarità (>75%). • Il simbolo.indica una media similarità (50%-75%).

31. Quando le sequenze da allineare non sono molto divergenti (similarità >50% per le proteine e >70% per gliacidinucleici) ClustalWdàunarispostaottimale • In casocontrariosononecessariaggiustamenti (correzionemanualedell’allineamento) • Unavoltache 2 o + seqsiano state allineate in un cluster, questoallineamento è fissato e non puòpiùesseremodificatonellefasi successive dell’allineamentoprogressivo. • Problemidiminimo locale: se in unaqualunquefasevieneintrodotto un erroresipropagheràsullefasi successive • Affidabilità del multiallineamentodipendedanchedal set diseq considerate – es. Se si include unaseq non realmenteomologaallineamentoprodottorisultaalteratodainserzionemolti gap addizionali (controlloseq input per rimuoverequelle “spurie”)

32. VANTAGGI DI CLUSTAL-W • Accorgimenti per rendere meno soggetta ad errori la procedura di allineamento progressivo; • Matrici di sostituzioni diverse a diverse distanze evolutive (si seleziona la FAMIGLIA DI MATRICI piuttosto che una specifica MATRICE); • Variazione delle penalità da attribuire ai gap a seconda della matrice scelta e della posizione in cui inserirli; • Penalità maggiori per gap distanziati da meno di 8 aa; • Penalità aggiustate localmente a seconda dell’aa che precede inserzione del gap; • Cut off di identità (40%) per evitare inclusione di seq divergenti finchè quelle più simili sono state allineate;