MONITORAGGIO EPIDEMIOLOGICO DELLE INFEZIONI POLMONARI IN PAZIENTI FC Silvia Campana

1. MONITORAGGIO EPIDEMIOLOGICO DELLE INFEZIONI POLMONARI IN PAZIENTI FC Silvia Campana Centro Fibrosi Cistica, Dipartimento di Pediatria Università di Firenze

2. PROTOCOLLI PER IL CONTROLLO DELLE INFEZIONI NEI CENTRI FC • Raccomandazioni del Cystic Fibrosis Trust’s Control of Infection Group, UK • (J.W. Govan 2001) • Protocollo delle infezioni nel Day Hospital del Centro FC della Toscana • (F. Festini, G. Taccetti, S. Campana, G. Mergni) • Infection control recommendations for patients with cystic fibrosis: • Microbiology, important pathogens, and infection control practices to prevent • patient-to-patient transmission. (Saiman et al. 2003 Am J Infect Control)

3. PROTOCOLLO PER IL CONTROLLO DELLE INFEZIONI NEL CENTRO FC DI FIRENZE 1) Sommario delle evidenze disponibili al momento 2) Raccomandazioni per: sorveglianza epidemiologica limitare la diffusione delle infezioni limitare le diffusioni crociate 3)Misure di segregazione (misure dirette ad impedire il contatto tra pazienti colonizzati e non)

4. PROTOCOLLO PER IL CONTROLLO DELLE INFEZIONI NEL CENTRO FC Di FIRENZE 4)Misure di disinfezione : eliminazione della contaminazione batterica da locali dispositivi per spirometria e aerosol terapia 5) Misure di diluizione: aereazione locali limitare l’affollamento lavaggio delle mani 6) Norme comportamentali norme da osservare strettamente per i pazienti durante la loro permanenza al centro

5. MONITORAGGIO DELLE INFEZIONI RESPIRATORIE IN FIBROSI CISTICA • analisi microbiologica di campioni respiratori (ogni tre mesi) • valutazione della presenza di specifici anticorpi circolanti • anti-P. aeruginosa o anti-B. cepacia per evidenziare il • passaggio da colonizzazione superficiale a cronica • esecuzione di controlli sull’ambiente e sul personale ospedaliero • monitoraggio delle infezioni con tipizzazione molecolare di intraspecifica tutti i ceppi batterici isolati Anticorpi anti-P. aeruginosa

6. MONITORAGGIO DELLE INFEZIONI OSPEDALIERE: METODI DI TIPIZZAZIONE INTRASPECIFICA Tipizzazioni fenotipiche (basate su caratteristiche esterne): sierotipizzazione tipizzazione fagica tipizzazione piocinica Tipizzazione genomica random amplification of polimorphic DNA (RAPD) elettroforesi a campo pulsato (PFGE) Multilocus restriction typing (MRLT) BOX-PCR Fingerprinting indispensabile nel caso di batteri altamente adattabili e variabili quali quelli isolati da pazienti FC sierotipo 1 Y P. aeruginosa sierotipo 2 Y

7. TIPIZZAZIONE GENOMICA INTRASPECIFICA • L’analisi con endonucleasi di restrizione (REA) permette lo studio dell’intero genoma di un organismo • Permette di evidenziare piccolissime differenze genetiche fra organismi anche quando non si esprimono a livello del fenotipo • con tale metodica si riesce all’interno della stessa specie (tipizzazione intraspecifica) a distinguere i singoli microrganismi • (diversi per virulenza, patogenicità, etc) P. aeruginosa DNA DNA

8. TIPIZZAZIONE BATTERICA INTRASPECIFICA CON PFGE • I frammenti di DNA prodotti dagli enzimi di restrizione (15-20) vengono separati tramite elettroforesi • Data la grandezza dei frammenti di DNA così generati (da 0,2 a 9000 kb ) si utilizza una particolare tecnica elettroforetica: elettroforesi a campo pulsato (PFGE) in cui gli impulsi elettrici generati sono variabili in intensità e direzione

9. TIPIZZAZIONE BATTERICA INTRASPECIFICA CON PFGE • Tale tecnica induce i frammenti di DNA a riorientarsi più volte • nella migrazione verso una carica positiva che varia di posizione. • La risoluzione delle bande risulta notevolmente aumentata così • da rendere più semplice il confronto. • Si possono separare frammenti di DNA da 10 a 100 volte maggiori • di quelli separabili con l’elettroforesi convenzionale DNA

10. POTENZIALI FONTI DI INFEZIONI PER P. AERUGINOSA Fonti ambientali: diffuso in natura, nel suolo, nell’acqua le piante Portatori: colonizza la cute, l’orecchio esterno, l’intestino crasso di soggetti sani, infezioni gravi negli immunocompromessi e pazienti con fibrosi cistica. Fonti nosocomiali: soluzioni di lavaggio, disinfettanti, lavandini, endoscopi, piscine per fisioterapia, spirometri. La maggior parte dei serbatoi è associata all’UMIDITA’.

11. Ceppi epidemici di P. aeruginosa in FC • 55 bambini Liverpool • (Lancet 1996; 348: 639-42) • 22 adulti Manchester • (Lancet 2001; 358: 557-58) • 5 pazienti Liverpool • (Lancet 2001; 358: 558-60) • IMPORTANZA DI UNA SORVEGLIANZA BATTERIOLOGICA CON PFGE 1 2 3 4 5 6 Profilo geneticodi ceppi di P. aeruginosa isolati da pazienti FC Sono stati analizzati ceppi di P. aeruginosa provenienti da 80 pazienti che si sono dimostrati genotipicamente diversi eccetto per 5 coppie di pazienti che a due a due mostrano ceppi con lo stesso profilo genetico.

12. ANALISI CON PFGE DI P.AERUGINOSA a ba ba ba b 1 2 3 4 a ba ba b 5 6 7 8 • Ceppi di P. aeruginosa isolati da pazienti FC (1-7) analizzati con elettroforesi a campo pulsato (PFGE). Fenotipi diversi delle colonie: mucoidi e rugose (a e b) sono isolati dallo stesso paziente. N° 8 mostra un ceppo di isolamento ambientale.

14. POTENZIALI FONTI DI INFEZIONI PER S. AUREUS • Attualmente tutti i ceppi di S. aureus producono ß-lattamasi • Negli anni 60 in seguito all’uso di meticillina è stato isolato il primo ceppo di MRSA • La prevalenza di isolamento di MRSA è progressivamente aumentata in abito nosocomiale (terapie intensive) ed anche nei pazienti con FC • la trasmissione avviene per contatto diretto paziente-paziente o indiretto attraverso individui sani compreso il personale ospedaliero.

15. ANALISI CON PFGE DI MRSA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ceppi di Staphylococcus aureus meticillino-resistenti analizzati con PFGE isolati da 9 pazienti FC Campana S., et al J of Cystic Fibrosis. 2004.

16. B. cepacia complex e genomovars : concetti in espansione Genomovars I (B.cepacia) II (B. multivorans) III (B. cenocepacia) IV (B. stabilis) V (B. vietnamiensis) VI (B. dolosa) VII (B. ambifaria) VIII (B. anthina) IX (B. pyrrocinia) • almeno 9 specie geneticamente diverse • all’interno del “complex”, se i test biochimici consentono l’identificazione, si attribuisce al genomovar un nome specifico (ad es. genomovar II --> B. multivorans), altrimenti viene usato il termine genomovar seguito da numerazione romana.

17. The present species concept(Wayne et al. 1987, Ursing et al. 1995) • "...The phylogenetic definition of a species generally would include strains with at least 50 - 70% DNA-DNA relatedness ...” • “...It is recommended that a distinct genospecies that cannot be differentiated from another genospecies on the basis of any known phenotypic property not be named until they can be differentiated by some phenotypic property...” • La definizione filogenetica di specie prevede che si possano includere nella stessa specie organismi che abbiano almeno il 70% di omologia del DNA • I vari genomovar di B. cepacia hanno un grado di omologia inferiore al 70% pertanto appartengono a specie diverse

18. POTENZIALI FONTI DI INFEZIONI PER B. CEPACIA • Gli ultimi studi tassonomici identificano 9 genomovar o specie genomiche (omologia genetica maggiore del 70% analizzata con studi di ibridazione del DNA) • Genomovar VI si isola solo da pazienti FC • I genomovar I, II, III, IV, VII, VIII e IX sono isolati da fonti umane ed ambientali (isolamento prevalente dal suolo, campi di cipolle, rizosfera del mais) • Uso in agricoltura quale biopesticida e fertilizzante.

19. ANALISI CON PFGE DI B. CEPACIA PAZIENTI FCPAZIENTI ONCOLOGICI Profilo genetico di ceppi di B. cepacia isolati da pazienti FC(1-6) e da pazienti oncologici (7-8-9) eseguita con PFGE

20. PREVALENZA DI B. CEPACIA COMPLEX (%) Canada* (n = 445) 0.2 9.7 82.9 3.8 1.6 - - - - USA * (n = 606) 2.6 37.8 50.0 0.2 5.1 2.0 0.7 - - Italy (n = 178) 12.3 5.6 63 7.8 0.6 - 0.6 0.6 4.5 Genomovar I (B.cepacia) II (B. multivorans) III (B. cenocepacia) IV (B. stabilis) V (B. vietnamiensis) VI (B. dolosa) VII (B. ambifaria) VIII (B. anthina) IX (B. pyrrocinia) * Speert et al (2002), LiPuma et al (2001), Campana et al Pediatr. Pulmonol (2003)

21. RISULTATI DELL’ANALISI CON PFGE ( 133 ceppi di B. CEPACIA ISOLATI DA 18 Centri FC Italiani ) 57 (43%) degli isolati producono un profilo genetico singolo 76 (57%) degli isolati sono divisi in 19 gruppi 6 gruppi contengono 2 ceppi– ogni coppia proviene dallo stesso Centro FC 8 gruppi contengono da 3 a 8 ceppi provenienti dallo stesso centro 5 gruppi contengono isolati provenienti da più di un centro

22. Scelta della tecniche di tipizzazione genetica studi epidemiologici su bassa scala random amplification of polimorphic DNA (RAPD) elettroforesi a campo pulsato (PFGE) studi epidemiologici su larga scala Multilocus restriction typing (MRLT) BOX-PCR Fingerprinting

23. Tecniche di tipizzazione genetica Symilarity % Ceppi di B. cepacia T. Coenye et al. J Clin Microbiol 2002

24. COME SI EVIDENZIA UN CLONE EPIDEMICO? • In base al tipo di approccio metodologico si può arrivare a • conclusioni diverse • importanza della scelta del metodo di genotipizzazione • in base al tipo di studio