Le metodologie di studio del cervello: SYSTEMS BIOLOGY

1. Le metodologie di studio del cervello: SYSTEMS BIOLOGY Alessia Stell 13.04.10

2. IV secolo A.C ARISTOTELE considera il cervello come un meccanismo di “raffreddamento” del sangue. IV secolo A.C IPPOCRATE ipotizza che il cervello sia sede dell’intelli-genza MEDIOEVO Si studiano disturbi neurologici e psichiatrici (tra cui il mal d’amore) 1674 Anton van Leeuwenhoek costruisce il primo microscopio

3. La nascita delle neuroscienze “La reazione nera” neuroni come entità singole che sono in contatto e si succedono l'una all'altra

4. Studio del cervello: UN APPROCCIO RIDUZIONISTICO

5. Studio del cervello: UN APPROCCIO OLISTICO “lo studio delle interazioni e degli interscambi che avvengono a diversi livelli dell’informazione biologica”

6. Il confronto dei due approcci APPROCCIO SYSTEMS BIOLOGY I sistemi biologici vengono affrontati non più come insieme di entità separabili, ma come network di molecole interagenti, che si influenzano a vicenda Permette di comprendere la complessità di un sistema in termini di cambiamenti quantitativi e temporali. APPROCCIO RIDUZIONISTICO Focalizzato su pochi geni e sui loro prodotti proteici Si ottiene solo una comprensione parziale dei complessi meccanismi eziopatologici

7. Da dove deriva la complessità del nostro organismo? 25.000 geni codificanti Il tutto è maggiore della somma delle sue singole parti

8. Systems Biology cerca di studiare le PROPRIETA’ EMERGENTI Queste proprietà sono caratteristiche inattese dell’insieme, che non possono essere dedotte se osserviamo solo i componenti e non l’interazione complessa

9. Da Systems Biology a Systems Neuroscience 302 neuroni 5000 connessioni C.Elegans Possono essere usati tool computazionali per definire le connessioni Possono essere mappate le interconnessioni nervose specifiche di determinati pathways e circuiti comportamentali Possono essere quindi tracciate relazioni causali dirette tra l’attività neuronale e il comportamento

10. Da Systems Biology a Systems Neuroscience 100 miliardi neuroni 5 x 10^14 connessioni Devono essere utilizzati approcci diversi che consentano di comprendere la complessità

11. Metodi di studio di Systems Biology Genomica Sequencing Epigenomica ChIP-chip, ChIP-seQ… Trascrittomica Microarray e Sequencing Proteomica Mass Spectrometry e ProteinMicroarrays

12. Porta alla determinazione della struttura primaria di un polimero Metodo Sanger Automatizzazione del metodo di Sanger Next-Generation Sequencing Sequencing

13. Sequencing – Metodo Sanger chain-terminator method dideoxynucleotide triphosphates (ddNTPs), lacking a 3'-OH group required for the formation of a phosphodiester bond between two nucleotides 1975

14. Sequencing - Automatizzazione del metodo di Sanger 1975 2000

15. Sequencing – SHOTGUN Sequencing Human Genome Project

16. Sequencing – Next Generation Throughput: Costi: Sanger: 0.1 Mbp/day NGS: 5 Gbp/day (5000 Mbp/day) Incremento di 50.000 volte Sanger: 500$/Mb NGS: 1-2$/Mb Riduzione 500 volte

17. Sequencing – Next Generation Roche 454 Illumina Solexa Abi SoLID

18. Sequencing – Solexa Technology

19. Epigenomica • Modificazioni della architettura del DNA, non dovuta a modificazioni della struttura primaria (sequenza) • ChIp-chip / ChIP-Seq • DamID

20. Epigenomica Modificazioni del DNA Metilazione Modificazioni degli Istoni (N-term) Acetilazione MetilazioneUbiquitilazioneFosforilazioneSumoilazione

21. Epigenomica – ChIP-chip/ChIP-Seq Il principio della Chromatin immunoprecipitation è quello di ISOLARE le porzioni di cromatina che interagiscono con proteine specifiche (in questo caso ISTONI) dal complesso miscuglio di DNA, attraverso l’uso di ANTICORPI specifici

22. Epigenomica – ChIP-chip/ChIP-Seq ChIP-Seq Identificando le sequenze, si può capire DOVE si localizzano i gli istoni, quanto è compatta la cromatina, e se queste condizioni cambiano nel tempo o in condizioni diverse

23. Epigenetica - DamID (DNA adenine methyltransferase identification) DNA-binding protein as a fusion protein with DNA adenine methyltransferase localizes the methyltransferase in the region of the binding site Adenosine methylation

24. Trascrittomica • Modificazioni dell’espressione del DNA, quindi dei livelli di RNA messaggero • Real Time PCR • Expression Microarrays

25. Proteomica • Modificazioni del livello delle proteine all’interno di una cellula, e della loro funzione • Mass Spectrometry • Protein Microarrays

26. Proteomica – Mass Spectrometry Determinazione della struttura elementare di un campione o di una molecola (peptidi). Il principio della massa si basa sul diverso rapporto massa/carica dei componenti che vengono ionizzati e accelerati in un campo elettrico Ionizzazione: MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization) Detector Campo Elettrico

27. Proteomica – Protein Microarrays Per determinare la presenza e quantificare la proteina di interesse in un campione

28. Epigenetica & Trascrittomica Genomica & Trascrittomica Proteomica Esempi di studi Systems Biology Biology today relies heavily on genomic data for hypothesis building. Replacement from “descriptive science” to “discovery science”

29. Epigenetica & Trascrittomica altered epigenetic profiles in human neoplasia Cancer Biol 2009 Uso di anticorpi specifici per Citosine metilate ChIP-chip

30. Genomica & Trascrittomica Science 2008 Scopo: identificare alterazioni geniche in pazienti con GBM, e la loro associazione con la patologia Genomica: sequencing  Trascrittomica:Microarrays  Fisiologia:survival Isocitrate Dehydrogenase 1_ - non associato precedentemente con GBM - altamente mutato in GBM (mutazioni puntiformi G>A) - associato a miglior survival

31. Proteomica Proteomica è il metodo di elezione per lo studio delle proteine delle vescicole post-sinaptiche, poiché i profili di espressione non sono in grado di fornire dati accurati Identificazione dei complessi con la proteina PSD-95(post-synaptic protein)  identificarte 118 proteine Identificazione dei pathways in cui tali proteine sono coinvolte (schizofrenia)

32. Nuovi approcci in SYSTEMS BIOLOGY Data Sharing Network Integrazione di dati genotipici e fenotipici Simulazioni e informatica

33. Nuovi approcci in SYSTEMS BIOLOGY Data Sharing Network Integrazione di dati genotipici e fenotipici Simulazioni e informatica

34. Data sharing “omics” reaserach richiede non solo una strumentazione high-throughput e un team multidisciplinare di biologi, informatici, statistici, ma richiede anche, e in modo fondamentale, un cambio di prospettiva. In questa nuova prospettiva assume un ruolo fondamentale il DATA SHARING • Brain Atlases • Human proteome Project

35. Allen Brain Atlas http://www.brain-map.org/ • Mouse Brain • Developing mouse brain • Mouse spianl cord • Human Cortex In situ Hybridization Per combinare GENOMICA e NEUROANATOMIA, creando una mappa di espressione genica nel cervello

36. GENSAT GENE EXPRESSION NERVOUS SYSTEM ATLAS Database pubblico di espressione genica ne SNC di topo allo stato embrionale e nel topo adulto Basato su bacterial artificial chromosome (BAC)-transgenic reporter mice

37. Human Brain proteome project HUPO BPP is an open international project under the patronage of the Human Proteome Organisation (HUPO) that aims: · to analyze the brain proteome of human as well as mouse models in healthy, neurodiseased and aged status with focus on Alzheimer'sand Parkinson's Disease· to perform quantitative proteomics as well as complemantary gene expression profiling on disease-related brain areas and bodily fluids· to advance knowledge of neurodiseases and aging in order to push new diagnostic approaches and medications· to exchange knowledge and data with other HUPO projects and national / international initiatives in the neuroproteomic field· to make neuroproteomic research and its results available in the scientific community and society

38. Nuovi approcci in SYSTEMS BIOLOGY Data Sharing Network Integrazione di dati genotipici e fenotipici Simulazioni e informatica

39. Network SYSTEMS BIOLOGY integra dati che derivano da analisi genetiche, gene expression, esperimenti di proteomica e neurobiologici NETWORKS sistemi di unità interconnesse in grado di interagire e influenzarsi a vicenda Quando i network sono studiati nel loro insieme, emergono proprietà che non possono essere derivate dall’analisi individuale dei componenti

40. WGCNA From LISTS of genes… …To networks WEIGHTED GENE CO-EXPRESSION NETWORK ANALYSIS (WGCNA) Il profilo di espressione può essere organizzato in networks secondo correlazioni di espressione

41. WGCNA: esempio Nature Neuroscience 2008 Cortical Areas Caudate Nucleus

42. Network: esempio di studio di geni coinvolti in Atassia PROTEOMICA + BIOINFORMATICA Identificazione di proteine che interagiscono con proteine atassia-specifiche Identificazione di nuovi partner attraverso lo studio di database di interazioni  altre 7000 proteine Identificazione di nuovi pathway coinvolti in atassia e altre patologie degenerative

43. Nuovi approcci in SYSTEMS BIOLOGY Data Sharing Network Integrazione di dati genotipici e fenotipici Simulazioni e informatica

44. Integrating genotypic and phenotypic data Expression Quantitative Trait Locus (eQTL) analysis Genotypic Data: SNPs in un campione di pazienti Phenotypic Data: Espressione Genica Determinare quali regioni del genoma sono più INDICATIVE di uno stato fisiologico o patologico

45. Nuovi approcci in SYSTEMS BIOLOGY Data Sharing Network Integrazione di dati genotipici e fenotipici Simulazioni e informatica

46. Simulazioni e Bioinformatica “We’re literally drowning in data. We have lots of scientists who spend their life working out important details, but we have virtually no idea how all these details connect together. Blue Brain is about showing people the whole.” (Henry Markram, director of BBP)

47. Simulazioni e BioinformaticaBLUE BRAIN PROJECT - Iniziato nel 2005 - Più di 2000 microchips connessi - 22.800 miliardi di operazioni al secondo Raggiunto primo traguardo: Simulazione del firing in una colonna neocorticale (10.000 neuroni/30 milioni di connessioni)

48. Conclusioni • Systems Biology è “lo studio delle interazioni e degli interscambi che avvengono a diversi livelli dell’informazione biologica” • E’ possibile grazie all’avvento di nuove tecniche di throughput e informatiche

49. Conclusioni Le scienze “omiche” non andranno a sostituire le scienze riduzionistiche. Gli approcci “omici” offrono una nuova base su cui le scienze riduzionistiche possono essere fondate, dal momento in cui permettono di testare molte ipotesi in parallelo e offrono un contesto di ampio respiro per l’interpretazione dei dati.