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Tests génotypiques: réalisation, interprétation

Tests génotypiques: réalisation, interprétation. Dr Laurence Morand-Joubert 10 décembre 2010. Phénotype Virus (isolat du patient) RT-PCR ADN gènes RT et PR Introduction ds vecteur Transfection Virus recombinant Infection Mesure de la sensibilité aux ARV (CI50). Génotype

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Tests génotypiques: réalisation, interprétation

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  1. Tests génotypiques: réalisation, interprétation Dr Laurence Morand-Joubert 10 décembre 2010

  2. Phénotype Virus (isolat du patient) RT-PCR ADN gènes RT et PR Introduction ds vecteur Transfection Virus recombinant Infection Mesure de la sensibilité aux ARV (CI50) Génotype Virus (isolat du patient) RT-PCR ADN gènes RT et PR Séquençage Séquence Ac Aminés Mutations de Résistance Interprétation Prédiction de la sensibilité aux ARV Outils pour évaluer la résistance: Génotype / Phénotype

  3. Séquençage automatique • Utilisation des di-désoxynucléotides (pas de groupement OH en 3 ’) • (Réaction dans un seul tube: Séquençage en dye-terminator) • Marquage des ddNTP par un fluorochrome de couleur différente • vert pour didésoxyA, bleu pour didésoxyC, jaune pour didésoxyG et rouge pour didésoxyT • Séparation puis lecture des taches successives (couleur) par un laser

  4. Résistance génotypique Insertion de deux sérines en position 69

  5. Techniques disponibles: « artisanales » Trugene HIV-1 genotyping kit de Visible Genetics HIV-1 Genotyping de Perkin Elmer Applied Biosystems, commercialisé par Abbott Résistance génotypique

  6. Méthode d ’identification des mutations de résistance Mise en culture: souches VIH-1 référence + concentrations croissantes ARV Calcul CI50 (CI90) Identification des mutations responsables  CI50 Séquençage RT + PR: identification des mutations sélectionnées par l ’ARV Test phénotypiques sur les virus mutés: impact des mutations sur la CI50 MUTAGENESE DIRIGEE 1- Introduction des mutations observées dans une souche de référence 2- vérification de la sensibilité phénotypique des isolats porteurs de mutations (isolée ou en combinaison)

  7. Méthode d’identification des mutations de résistanceConstruction des algorithmes de résistance • Tests phénotypiques sur des isolats cliniques • Mise en culture des isolats cliniques • - définis génotypiquement pour être résistants (à d’autres molécules/même classe) • - en présence de l ’ARV étudié • = Exploration des résistances croisées in vitro Corrélation mutations à l ’initiation de l’ARV et réponse virologique = Prédiction de la réponse à l’antirétroviral Recherche de l ’apparition de mutations de résistance sous ARV

  8. Construction des algorithmes de résistance Corrélation mutations à l ’initiation de l’ARV et réponse virologique • Etablissement des règles • Identifier les mutations ou les ensembles de mutations associées • à la réponse virologique • -Bâtir le meilleur score • Déterminer des classes de réponse • Prendre en compte les facteurs de confusion • Prévalence suffisante des différentes mutations impliquées • Non observance • Toxicité • Validation • Confirmer la valeur prédictive sur un échantillon indépendant

  9. Construction des algorithmes de résistance Corrélation mutations à l ’initiation de l’ARV et réponse virologique • Etudes utilisées • Etude d’intensification avec un ARV (Jaguar  ddI, 902-907 TDF) • CV faible, CD4 relativement élevés • Critère de jugement précoce à S2 ou S4 • Mesure la puissance intrinsèque de l’ARV • Pas la pratique courante et population particulière • -Etude de changement de traitement • Problèmes des autres ARV associés • Critère de jugement entre S8 et S24 (plus c’est tard et plus il y a un risque de modification de traitement) • Pratique recommandée Un algorithme n’est valide que pour la population de patients dont il est issu

  10. Basé sur la corrélation entre le génotype et le phénotype Méthode d’identification des mutations de résistanceConstruction des algorithmes de résistance

  11. 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Relation entre résistance (augmentation de l’ IC50) au lopinavir et nombre de mutations Nombre de mutations 0–3 4–5 6–7 8–10 Augmentation de l’IC50 0.8 2.7 13.5 44.0 Augmentation de l’ IC50 du lopinavir Nombre de mutations* *Panel de mutations: 10, 20, 24, 46, 53, 54, 63, 71, 82, 84 et 90 Kempf et al. Antivir The 2002; 7 : 165-174

  12. Basé sur la corrélation entre le génotype et le phénotype Basé sur la corrélation entre le génotype et la réponse virologique Méthode d’identification des mutations de résistanceConstruction des algorithmes de résistance

  13. Corrélation entre le phénotype/génotype et la réponse virologique au lopinavir/r (Etude 957) Réponse viroloque en fonction du génotype Réponse viroloque en fonction du phénotype <10 fois l’IC50 100 100 0–5 mutations 80 80 De 10 à 40 fois l’IC50 60 60 6–7 mutations Pourcentage de patients répondeurs 40 40 20 > à 40 fois l’IC50 20 8–10 mutations 0 0 0 12 24 36 48 0 12 24 36 48 Semaines Semaines Etude 957: pts en multiples échecs d’IP mais INNRT naïfs Kempf et al. Antivir The 2002; 7 : 165-174

  14. Génotype /Phénotype à baseline / Réponse Virologique à l ’ATV • Score de 14 mutations: 10, 20, 24, 33, 36, 46, 48, 54, 63, 71, 73, 82, 84, 90 • ATV seul:  4 mutations à BL=> échecs dûs à la résistance chez >50% des patients traités • ATV/r:  6 pour une résistance chez > 50% des patients Colonno. 2nd European HIV Drug Resistance Workshop, Rome, March 04. Poster 3.1

  15. Génotype à BL / Réponse virologique à l’abacavir (Essai Narval) Nombre de mutations parmi M41L, D67N, L210W, T215Y/F, M184V/I, L74V Brun-Vézinet F et al. AIDS 2003 ; 17 : 1795-802

  16. Génotype à BL / Réponse virologique à l’abacavir (Essai Narval) Decrease in HIV-1 plasma RNA (logcopies/ml) -0.19 -0.67 -1.64 Pas de résistance Résistance possible Résistance  Probabilité de réponse en fonction d’un nombre de mutations définies Brun-Vézinet F et al. AIDS 2003 ; 17 : 1795-802

  17. 0 -0.1 (n=46) -0.2 (n=81) -0.3 Mean DAVG24(log10 copies/mL) (n=106) -0.4 -0.5 (n=79) (n=222) -0.6 (n=57) -0.7 (n=25) (n=67) -0.8 All substudy patients 215 - No 41 or 210 L210W D67N K219Q/E/N T215Y/F +/- 41/210 M4IL K70R P = <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.025 0.012 Génotype à BL / Réponse virologique au Ténofovir (Etudes 902-907) Margot NA et al. AIDS 2002;16: 1227-35

  18. n = 222 110 68 29 55 33 57 29 42 19 0.1 0 -0.1 -0.2 * Tenofovir DF -0.3 Placebo Mean DAVG24 (log10 copies/mL) -0.4 -0.5 -0.6 ** ** ** -0.7 ** -0.8 All patients No TAMs 1 or 2 TAMs ≥3 TAMs ≥3 TAMs with M41L or / no M41L or L210W L210W Génotype à BL / Réponse virologique au Ténofovir (Etudes 902-907) **P≤0.0001 *P=0.013 • Probabilité de réponse en fonction d’un nombre et de la nature de mutations définies Margot NA et al. AIDS 2002;16: 1227-35

  19. Résistance au LPV/r chez les patients prétraités par IP • A partir des différentes analyses de corrélations phénotype/génotype et des corrélations génotype/réponse virologique Mutations à des positions connues K20I I54A/S L63T V82S Mutations APV V32I I47V I54M ANRS: L10F/I/R/V K20M/R L24I M46I/L I50V F53L I54L/T/V L63P A71I/L/V/T V82A/F/T I84V L90M ATU française Nouvelles mutations L33F M36I G48V L90M Pré-traitement INNRT? Parkin et al, Isscson et al, Loufty et al9th CROI, Seattle, 2002

  20. Résistance au LPV/r chez les patients prétraités par IP: définition • A partir des différentes analyses de corrélations phénotype/génotype et des corrélations génotype/réponse virologique •  6 mutations dans les recommandations actuelles • À partir des études 765 et 957 (patients naïfs d’INNRT) • À partir des données de l’ATU française •  3 mutations • A partir d’une étude canadienne chez 167 patients (INNRT: 67%) • Chez les patients prétraités, la résistance au Kaletra dépend de la nature et du nombre de mutations sur le gène de la protéase • Mais le nombre et la nature de ces mutations diffèrent selon la population étudiée (de l’histoire thérapeutique antérieure des patients) Loufty et al 9th CROI, Seattle, 2002

  21. Analyse de la réponse au lopinavir/r en fonction du nombre de mutations au LPV/r 80 ATU LPV 70 BMS-045 TITAN 60 RESIST 50 ARN VIH < 50 c/ml (%) 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Nombre de mutations LPV 38 TITAN = liste IAS1 ; BMS-045 = liste FDA2 ; ATU LPV France3 ; RESIST = liste Abbott 20014 1 Johnson V. Top HIV Med 2007;15:119-25 ; 2 Laboratoires Abbott (www.kaletra.com) ; 3 King M. Antimicrob Agents Chemother 2007;51:3067-74 ; 4 Kempf DJ. J Virol 2001;75:7462-9 A Hill, XVII IHDRW 2008, Abs. 126

  22. Evolution de l’algorithme du LPV/r Même série de mutations mais seuil diminué Hill A et al. Re-evaluation of resistance algorithms for lopinavir/ritonavir in the TITAN trial. XVII International HIV drug resistance workshop : basic principles and clinical implications, 10-14 June 2008, Sitges, Spain, abstract 126.

  23. 13 TMC125 RAMs ont été identifiée à baseline ayant un impact significatif sur la réponse virologique Effet étudié dans le sous-groupe de patients sans enfuvirtide de novo et excluant les patients ayant arrêté pour de raisons autres que l’échec virologique (n=406) Les réponses virologiques dans l’analyse à S24 sont présentées comme la proportion de patients ayant une CV confirmée à <50 HIV-1 RNA copies/ml La réponse virologique diminuée est définie comme une réponse au moins 25% inférieure à celle du sous-groupe de patients sans INNTI RAMs détectables à baseline (n=52). Ces patients avaient des mutations aux INNTI sur des génotypages antérieurs Les mutations sur la RT étaient inclues dans l’analyse si présentes à baseline dans au moins 5 patients Identification des TMC125 RAMs TMC125 RAMs Vingerhoets J, et al. 11th EACS 2007. Poster P7.3/05.

  24. No.de patientsavecmutation à baseline No. ofpatientsavec <50 cps/mlà S 24 Taux de réponse (<50 cps/ml) dans DUET compilé (%) ETR FC (single SDM) Table 1. Vue des mutations aux INNTI Mutation V90I 22 11 50.0 1.5 A98G 59 29 49.2 2.5 A98S 38 26 68.4 0.4 L100I 34 18 52.9 1.8 K101E 53 24 45.3 1.7 K101H 26 11 42.3 1.3 • Liste des 44 INNTI RAMs étendue à 57 mutations en ajoutant toutes mutations aux positions (acides aminés) de résistance aux INNTI • La fréquence et la réponse virologique chez les patients avec mutations à baseline sont montrés (si n5), de même que les ETR FC sur souche à mutagénèse dirigée (SDM) • M230L a été ajoutée sur la d’un fort effet sur FC, bien que n=4 • L100I était déjà incluse antérieurement, bien que le taux de réponse était au dessus du seuil (voir Figure 1) K101P 9 4 44.4 6.2 K101Q 35 20 57.1 3.4 K101R 5 3 60.0 0.7 K103N 118 82 69.5 0.7 K103R 9 2 22.2 0.8 K103S 16 12 75.0 0.9 V106I 24 9 37.5 NA V108I 66 42 63.6 0.5 E138A 12 6 50.0 2.0 E138Q 10 8 80.0 5.1 V179D 5 2 40.0 2.6 V179F 7 1 14.3 0.1 V179I 97 60 61.9 0.8 V179T 8 3 37.5 0.8 Y181C 110 50 45.5 3.9 Y181I 8 4 50.0 12.5 Y181V 6 2 33.3 17.4 Vingerhoets J et al. XVII IHDRW, Sitges, 2008. Abstract 24 Y188L 32 24 75.0 0.9 V189I 24 13 54.2 0.8 G190A 115 58 50.4 0.8 G190S 14 3 21.4 0.2 ETR RAMs 2008 H221Y 35 23 65.7 2.5 P225H 5 3 60.0 1 F227L 20 13 65.0 0.4 Taux de réponse en dessous du seuil (<51.9%) M230L 4 2 50.0 3.4 K238T 10 9 90.0 2.4 ETR FC >3.0 Y318F 13 10 76.9 1.4 N348I 60 35 58.3 NA Les mutations suivantes étaient présentes dans <5 patients à baseline: K101N, K103H, K103T, V106A, V106M, E138G, E138K, V179A, V179E, V179G, Y181F, Y188C, Y188F, Y188H, G190C, G190E, G190Q, G190R, F227C, M230I, M230L, P236L, K238N and N348T

  25. Effet des ETR RAMs 2008 (n=17) sur réponse virologique 80 70 60 75% de réponse chez les patients sans INNTI RAMs 50 Patients avec CV confirmée <50 copies/ml (%) 40 30 20 10 7 52 34 115 22 12 8 4 59 110 53 9 26 5 24 8 6 14 52 34 115 22 12 8 4 59 110 53 9 26 5 24 8 6 14 7 0 V90l L100l Y181l A98G V106l V179T Y181V Y181C K101E K101P V179D V179F G190S G190A M230L E138A K101H *No mutation *Pas d’ INNTI RAM à baseline sur la liste des 44; Les nouvelles mutations de la liste d’ETR RAM 2008 sont souslignées Vingerhoets J et al. XVII IHDRW, Sitges, 2008. Abstract 24

  26. Table 2. Le facteur poids–ETR RAMs 2008 ETR FC dans le panel d’isolats cliniques VIH-1 avec 1 ETR RAM (n=1,619), indépedamment de la Prévalence (%) présence d’autre INTI ou dans le panel de Effet sur FC ETR FC INNTI RAMs* dans modèle 4,248 HIV-1 Poids (single Médiane Q1–Q3 n SDM) Mutation isolats cliniques linéaire facteur Y181I 1.5 42.0 34 12.5 Elevé 3 23.2–129.7 Y181V 0.9 10.4 28 17.4 Elevé 3 3.9–60.6 K101P 2.6 22.3 65 6.2 Elevé 2.5 5.6–42.9 L100I 8.4 6.7 264 1.8 Moyen 2.5 2.7–17 Y181C 32.0 4.4 552 3.9 Moyen 2.5 2.1–11.6 M230L 1.1 4.3 20 3.4 Elevé 2.5 2.7–10.5 E138A 2.5 2.9 44 2.0 Moyen 1.5 1.4–10.6 V106I 4.4 2.6 63 NA Bas 1.5 1.4–5.2 G190S 3.7 0.8 32 0.2 Bas 1.5 0.6–1.7 § V179F 0.7 – 0 0.1 Moyen 1.5 – V90I 6.8 2.0 97 1.5 Bas 1 0.8–3.6 V179D 2.1 1.7 33 2.6 Bas 1 1.0–4.7 K101E 9.9 1.5 24 1.7 Bas 1 0.8–2.5 K101H 2.2 1.1 8 1.3 Bas 1 0.6–2.8 A98G 9.5 1.0 127 2.5 Bas 1 0.5–1.9 V179T 0.6 0.9 2 0.8 Bas 1 0.7–1.2 G190A 23.3 0.8 226 0.8 Bas 1 0.5–1.5 *Médiane (Q1–Q3) FC pour tous les isolats était 3.0 (1.1–9.3); §V179F n’était jamais présente seule ETR RAM (toujours avec Y181C) Vingerhoets J et al. XVII IHDRW, Sitges, 2008. Abstract 24

  27. Prédiction de la réponse en fonction du score pondéré Total weighted score Poids donné à chaquemutation Vingerhoets J et al. IHDRW 2008. Abstract 24

  28. Les colonnes hachurées indiquent la réponse virologique pour la categorie entière N 115/148 37/53 6/11 11/15 32/59 2/7 19/36 1/5 14/27 3/9 4/9 4/13 1/3 2/11 Figure 6. Relation entre le score pondéré et la réponse virologique (<50 copies/ml) Réponse la plus élevée Réponse intermédiaire Réponse réduite Catégorie de réponse 74.4% 52.0% Patients avec CV confirmée <50 copies/ml (%) 37.7% Vingerhoets J et al. XVII IHDRW, Sitges, 2008. Abstract 24  Score pondéré pour les 17 ETR RAMs 2008

  29. La mutation E138K est sélectionnée in vitro par ETR chez des isolats B et non-B FC 5 AG E138K 4 3 NL43 E138K 2 1 ETR EFV NVP 40 Des expériences de sélection in vitro montrent la sélection systématique de la mutation E138K (isolats B, CRF02 et C) L’effet de E138K sur la résistance à ETR, EFV et à moindre niveau à NVP est confirmé par mutagenèse dirigée sur un virus de sous-type B (PNL43) et sur un virus CRF02_AG Asahchop EL, IHHRW 2010, Abs. 108

  30. Etude de 93 patients prétraités en échec virologique dans les essais DUET Les mutations les plus fréquemment sélectionnées sont les suivantes: V179F (16.1%), V179I (14.0%), Y181C (10.8%), V108I (8.6%) et K103N (7.5%) V179F et Y181C font déjà partie du score de mutations Les positions les plus fréquemment observées avec émergence de mutations sont: V179 (n=35) E138 (n=17) Y181 (n=15) K101 (n=13) Sélection in vivo de mutations de résistance à l’Etravirine dans les essais DUET 40 R 35 H T E M 30 C L A I 25 P A V Count of emerging amino acids 20 K Q P 15 V G F C R K T H 10 M Q E L 5 I I G P F 0 V179 E138 Y181 K101 RT position Vingerhoets J, et al. IHDRW 2010. Abstract 99

  31. Des mutations différentes sont observées au niveau du codon 138 (n=17) que ce soit à l’inclusion ou à l’échec d’ETR Tous ces changements d’acides aminés nécessitent seulement un seul changement nucléotidique Chez un patient, plusieurs mutations au niveau de ce codon E138A/E/P/Q sont apparues en même temps Sélection des mutations au niveau du codon 138 6 5 4 3 2 1 0 Emerging mutations observed at position E138 Count G Q K V P A Amino acid Amino acid changes are differences from the pHXB2D consensus sequence Vingerhoets J, et al. IHDRW 2010. Abstract 99

  32. Effet de la sélection des mutations au niveau du codon 138 sur la résistance phénotypique Vingerhoets J, et al. IHDRW 2010. Abstract 99

  33. Mutations associées à la résistance à ETR chez des patients infectés par des VIH-1 non-B • Au moins 1 mutation ETR : 12,1 % des patients. 2 mutations ETR : 0,5 % Maïga A, AAC 2010

  34. Maïga A, AAC 2010

  35. Evolution de l’algorithme de l’ETR

  36. Basé sur la corrélation entre le génotype et le phénotype Basé sur la corrélation entre le génotype et la réponse virologique Basé sur la valeur prédictive de mutationsnon associées classiquement à la résistance ex: mutations transitionnelles Méthode d’identification des mutations de résistanceConstruction des algorithmes de résistance

  37. Sous traitement INRT: T215T → T215S → T215F/Y Arrêt des INRT: T215F/Y → T215C ou T215D ou T215E PAS de résistance phénotypique induite avec T215S, T215C, T215D, T215E = phénotype sensible Pas de modification de la capacité réplicative Evolution rapide vers la mutation T215Y en présence d ’AZT  Ces mutations suggèrent la présence d ’une population virale réellement résistante, i.e T215Y/F. Le génotype conclue à la RESISTANCE Possible. Impact des mutations transitionnelles

  38. Algorithmes d’interprétation de la résistance génotypique: Exemples

  39. Association entre les différents algorithmes d’interprétation génotypique et la réponse virologique dans les essais DUET: Courbe ROC Vingerhoets et al. AIDS 2010

  40. ARN VIH-1 < 500-1000 copies/ml: amplification parfois difficile mais pas impossible Limites TECHNIQUES des tests de résistance

  41. Etude nationale, multicentrique transversale Réalisation systématique d'un test génotypique chez les patients traités à charge virale > 50 c/ml Séquençage TI et protéase obtenu pour 523 des 744 patients inclus Efficacité de l’amplification en fonction de la charge virale Etude ANRS MULTIVIR : prévalence de la résistance aux ARV en 2009 chez les patients traités • Prévalence de la résistance aux ARV en 2009 (algorithme ANRS) Assoumou L, IHHRW 2010, Abs. 147

  42. Sous-étude de PUZZLE 1 Traitement de sauvetage par 2 INTI/APV/LPV/r  RTV Génotype standard à J0, S2, S6 et S26 détection populations minoritaires par clonage et PCR sélective à J0 analyse de 8 patients en échec virologique à S26, ayant présenté une sélection de nouvelles mutations aux IP sous traitement Exemple d’un patient: Archivage de populations virales résistantes minoritaires Profil génotype de résistance 10I 20R 32I X 36I 46L XX 71V 82A 90M Géno Standard J0 33F= 42/132 Clones + (33 %) I47V: 0/42 clones + 54M: 0/132 Clones + Clonage J0 LPV/r + APV ± RTV CROI 2004 - C. Charpentier, Paris, abstract 57

  43. Archivage de populations virales résistantes minoritaires Profil génotype de résistance J0 L10I 20R 32I M36I M46L A71V V82A L90M 42/132 Clones + L33F 0/132 Clones + I54M 0/42 clones + I47V LPV/r + APV ± RTV S2 L10I 20R 32I L33F M36I M46L A71V V82A L90M S6 L10I 20R 32I L33F M46L A71V V82A L90M M36I S26 L10I 20R 32I L33F M36I M46L I47V I54M A71V V82A L90M Absence de I47V et I54M à J0 Émergence lente de la résistance (S26) - sélection de novo - population très minoritaire (< 1 %) Préexistence de la L33F (33 %) à J0 Émergence rapide de la résistance (S2) CROI 2004 - C. Charpentier, Paris, abstract 57

  44. Résistance aux antirétroviraux Recommandations Indications des tests génotypiques de résistance http://www.hivfrenchresistance.org

  45. En présence d’un échec virologique Sous traitement Pas ou peu de problème d’adhérence Des concentrations pharmacologiques satisfaisantes Lors d’une décision de modification du traitement Quand demander un test de résistance génotypique ? En Pratique :

  46. Réalisation d’un test génotypique de résistance lors du diagnostic de l’infection ou avant l’initiation du Tt avec la détermination du sous-type Réalisation d’un nouveau test si suspicion de surinfection Réinterprétation des anciens tests génotypiques avec l’algorithme en vigueur Pas de niveau de CV pour la réalisation d’un génotype (Pas d’indication sur un blip) Réalisation d’un test de tropisme avant la prescription d’un antagoniste du CCR5 Résistance aux antirétroviraux Recommandations

  47. A quoi sert la résistance génotypique dans la stratégie thérapeutique ? Amélioration globale de la prise en charge de l’infection Bonne valeur prédictive de l’échec : mise en évidence des résistances aux ARV prescrits et de ceux qui doivent être exclus Mauvaise valeur prédictive du succès: intervention des autres facteurs (adhérence, PK, …) ! Absence de mutation  Absence de résistance Pas de substitution par rapport à l’histoire thérapeutique (la résistance aux ARV prescrits au cours des 1ères lignes de traitement peut ne plus être détectée) Interprétation de la résistance par drogue et non par combinaison Conclusions

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