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ABP 34-36 “ Aprendiendo del estudio clínico del TGN1412”

ABP 34-36 “ Aprendiendo del estudio clínico del TGN1412”. Grupo A Curso 09-10. Caso del TGN1412. Marzo 2006 en “ Parexel Clinical Pharmacology Research Unit” Ensayo de fármaco biotec TGN1412 Ac monoclonal humanizado superagonista de CD28

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ABP 34-36 “ Aprendiendo del estudio clínico del TGN1412”

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  1. ABP 34-36 “Aprendiendo del estudio clínico del TGN1412” Grupo A Curso 09-10

  2. Caso del TGN1412 • Marzo2006 en “Parexel Clinical Pharmacology Research Unit” • Ensayo de fármacobiotecTGN1412 • Ac monoclonal humanizadosuperagonista de CD28 • Tratamiento de leucemialinfocítica y artritis reumatoide • Estudiofaseclínica I: 6 afectadosde fallomultiorgánico Clínica Parexel. Londres

  3. Activación de las células T MEDIANTE SUPERANTÍGENOS MEDIANTE ANTÍGENOS Requiere SÓLO 1 señal Requiere 2 señales distintas

  4. Humanización del anticuerpo 5.11.A1 5.11.A1 – CD 28 Humano TGN1412 – CD 28 Humano

  5. Inmunoglobulinas • Anticuerpo (Ig) = Fab (2 x (VL, CL, VH, CH1)) + Fc (CH2, CH3) • VH y VL presentan subregiones hipervariables o CDR (complementaritydeterminingregions), cuya estructura determina la especificidad por el Ag. • De las dos regiones constantes (CH y CL), la CH es esencial para las funciones efectoras de la Ig, que dependen de la interacción con otras células del S.I. y con moléculas del complemento.

  6. ImnunoglobulinasDominioIg • Constan de 70-110 aa y se clasifican en diferentes tipos de acuerdo a su tamaño y función • Sandwich de dos láminas βantiparalelas. Estabilizado por: • - Puentes de H • - Interacciones hidrofóbicas • - Puentesdisulfuro • Dominio IgCONSTANTE: • una hoja de 3 cadenas beta y otra de 4 • Dominio IgVARIABLE: • una hoja de 5 cadenas beta y otra de 4

  7. ImnunoglobulinasSuperfamiliaIg • La superfamiliaIgestácompuesta por proteínas que presentanuno o másdominiosIg • Implicadas en el reconocimiento, unión y adhesióncelular • Se cree que todos los miembros de la superfamiliaderivan de un ancestrocomún • Entre los miembros de la superfamilia: • Inmunoglobulinas solubles • Moléculas de coestimulación

  8. HIPÓTESIS Diferente nivel de expresión CD28 Diferente CD28 Otrashipótesis Tormentacitoquinas Agregación de TGN1412 DiferenteCTLA-4 CD33 Homólogos remotos

  9. Métodos • Bases de datos • Experimentales • Computacionales

  10. Bases de datos de proteínas • Familias • Pfam • PROSITE • Estructura • PDB • CATH • SCOP Secuencia Swiss-Prot

  11. Técnicasexperimentales de determinación estructural • Baja resolución (análisis cualitativo) • Técnicas espectroscópicas • Absorbancia UV-Vis • Fluorescencia • Dicroísmo circular • Espectroscopía de infrarrojos • Resonancia paramagnética electrónica (EPR) • Resonancia magnética nuclear (RMN) de 1H (1D y 2D) – Difusión traslacional • Ultracentrifugación analítica • Dispersión de la luz • Cromatografía de filtración en gel • Resolución media • Criomicroscopía electrónica • RMN de estado sólido • Alta resolución • Cristalografía de rayos X • RMN multinuclear y multidimensional

  12. Dicroísmo circular Dicroísmo circular  Se basa en el cambio de configuración electrónica molecular de un estado fundamental a un estado excitado, debido a la absorción de radiación electromagnética polarizada circular. Ley de Lambert-Beer Absorción diferencial: ER Absorción diferencial entre las ondas EREL Fenómeno de dicroísmo circular EL • Un haz de luz polarizado es aquel que tiene su vibración electromagnética en un solo plano. • Un haz de luz polarizado circularmente está formado por dos haces de luz de polaridad plana. • - Se obtiene girando el plano de polarización de forma continua y en un solo sentido alrededor del eje de propagación de la fase luminosa.

  13. Dicroísmo circular Los espectros de dicroísmo circular se obtienen generalmente en las regiones del ultravioleta cercano (250 a 350 nm) y lejano (180 a 250 nm) de la radiación electromagnética. La interacción de la radiación con la muestra induce un desfase y un cambio de magnitud diferenciales en ambos componentes circularmente polarizados de la luz(ER y EL), y estos fenómenos provocan una rotación del plano de polarización en un ángulo a y la distorsión de este plano genera una elipse en vez de una circunferencia Espectro de dicroísmo circular de estructurassecundariaspuras La absorción preferencial de un componente se mide como un valor de elipticidad(dicroísmo circular), que puede ser + o - Descomposición de luz linealmente polarizada en dos componentes de polarización circular

  14. Dicroísmo circular • Sólo determina la estructura secundaria • Los espectros de estructurassecundariaspuras NO son comparables con espectros que solamentetienen una fracción de esa estructura • No hayconsenso en el límite de las bandas del espectro de UV cercano y el UV lejano

  15. Espectroscopía de infrarrojo • Espectrometría de absorción que utiliza la región infrarroja del espectro electromagnético • Las moléculas absorben frecuencias específicas determinadas por su estructura (frecuencias resonantes) • Frecuencia absorción= frecuencia a la que el enlace o grupo vibra

  16. Espectroscopía de infrarrojo Un haz policromático se separa en dos en el separador 2. Uno de los haces hijo atraviesa la muestra y el otro una referencia 3. El detector registra la intensidad del haz transmitido: varia según la interferencia sea constructiva o destructiva 2 3 1

  17. Espectroscopía de infrarrojo • FTIR: Espectroscopía de infrarrojo con transformada de Fourier: • Interferograma • (intensidades vs tiempo) • Espectro IR • (intensidad vs frecuencia) • Información estructural: estructura secundaria Transformada de Fourier

  18. Espectroscopía de infrarrojo • Permite el estudio de moléculasidentificandosusgruposfuncionales • El grupomáscaracterístico y numeroso de las proteínas es el amida • Modos de vibración del grupo amida: • Aplicaciones: mediciones, control de calidad, mediciones dinámicas, cambios en el carácter o la cantidad de un enlace particular… • Sólo determina la estructura secundaria • No hayconsenso en el límite de las bandas • Vibración NH (amida A) • - Vibración amida I (enlace C=O): Correlaciónfrecuencia– estructura • - Vibración amida II • - Otros: vibraciones amida (III, IV, V, VI y VII), estiramientos (NC, CN y CC) y las deformaciones (CCN y CNC)

  19. Microscopía electrónica La microscopíaelectrónicautilizaelectrones en lugar de fotones o luz visible para formar imagenesmicroscópicas. Funcionamiento de un microscopioelectrònico: Generación del haz de electrones por un cañónelectrónico [2]. Los electrones [3] viajan en el vacío, y son acelerados por un alto voltaje y focalizado por medio de lentes magnéticas. Los electronesatraviesan la muestra [7]. Un conjunto de lentes magnéticasamplifican la señalresultante y forman una imagen sobre una placa fotográfica o sobre una pantalla sensible al impacto de los electrones. Captamos la imagen con un ordenador, con el que se lepuede dar color (ya que la imagenobtenida es en blanco y negro).

  20. Microscopíaelectrónica Tinción negativa Criomicroscopía La proteína se congela en nitrógeno líquido Haz de electrones Haz de electrones Proteína Proteína • Necesidad de software para reconstrucción tridimensional. Soporte de carbono Capa de carbón Imagen final Los electrones que inciden sobre la proteínasufrenmásdispersióny generan una imagenoscura Imagen final Los electrones que inciden sobre la sal del átomopesadosufrenuna mayordispersióny generan un fondo oscuro, mientras que los que atraviesan la proteínageneranuna imagenbrillante

  21. Cristalografía de Rayos X Incidencia de un haz de rayos X a través de un cristal (contiene la proteína en estudio) El hazescinde en diferentesdirecciones por la simetría de los átomos y por el fenómeno de difracción Los rayos X son difractados por los electrones de las moléculas de proteínacristalizada (patrón de difracción) La posición e intensidad de cada punto está determinada por las fases de las ondas que forma cada punto (mapa de densidadelectrónica) Construcción de modelo de proteína

  22. RMN Basado en propiedadesmecánico-cuánticas de protones o neutrones: Spin Aplicación de un campo magnético alterno  perturbación del spin Desaparición del campo  posición inicial de spins Cambio de estados liberaciónenergética captada por receptor Análisis computacional Imagen

  23. Cristalografía Rayos X vs RMN

  24. Métodos

  25. HIPÓTESIS Diferente nivel de expresión CD28 Tormentacitoquinas

  26. Hipótesis 1: Diferenteconcentración de CD28humano/macaco • Numerosos estudios desmienten una concentración diferencial del receptor  similar o igual Objetivo: Comparar la cantidad de CD28 en humanos y en macacos. Schraven B, Kalinke U. CD28 Superagonists: What Makes the Difference in Humans? Cell Press Immunity 2008.

  27. HIPÓTESIS Diferentenivelde expresión CD28 Diferente CD28 Tormentacitoquinas

  28. Hipótesis 2: Diferencia entre CD28 humano/CD28 macaco Objetivo Saber si TGN1412 se une a una región distinta del CD28 o con distinta afinidad en las dos especies. Métodos 1. ComparaciónsecuenciasCD28 humano/CD28 macaco: clustalW Department of Medicine, Duke University Medical Center, Durham, North Carolina 27710, USA. The calm after the cytokine storm: lessons from the TGN1412 trial. J ClinInvest. 2008 Jun;118(6):2365.

  29. Hipótesis 2: Diferencia entre CD28 humano/CD28 macaco 2. Localización y visualización en el modelo de las mutaciones en el receptor (VMD): - lugar de interacción? 3. Análisis de las energías de interacción: EBI-PISA No Descartar hipótesis Sí Modelaje CD28macaco - TGN1412 Comparación con CD28humano-TGN1412

  30. Hipótesis 2: Diferencia entre CD28 humano/CD28 macaco PROBLEMA!!! Secuencias distintas de CD28 de macaco en SwissProt y en el artículo estudiado

  31. Hipótesis 2: Diferencia entre CD28 humano/CD28 macaco

  32. Hipótesis 2: Diferencia entre CD28 humano/CD28 macaco Mutaciones en la regióntransmembrana.

  33. HIPÓTESIS Diferentenivelde expresión CD28 Diferente CD28 Tormentacitoquinas Diferente CTLA4

  34. Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4 • Búsqueda de proteínas homólogas de CD28 con PSI-BLAST. • TGN1412 se podría unir a CTLA-4 • Miramos unión del TGN1412 a CTLA-4 de las diferentes especies

  35. Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4 ¿Por qué es interesante mirar la unión a CTLA4? • Es un inhibidor de la activación de las células T • Diferencias en la unión TGN1412-CTLA-4 en diferentes especies podría dar diferentenivel de inhibición

  36. Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4 Objetivos • Averiguar si el TGN1412 se puede unir al CTLA-4 Métodos • Generación del modelo TGN1412-CTLA4 a partir del modelo de TGN1412-CD28 • Comparación de la unión TGN1412-CTLA4 en humano con la unión TGN1412-CD28 en humano • Comparación de la unión TGN1412-CTLA4 en macaco con la unión TGN1412-CTLA4 en humano

  37. Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4 Comparación de CTLA-4 humano con CD28 humano CD28 humano CTLA-4 humano ClustalW CD28humano – CTLA-4humano

  38. Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4 Comparación de CTLA-4 humano con CD28 humano CD28 humano – TGN1412 CTLA-4 humano – TGN1412 CD28h + 5.11A1 (molde) CD28h + TGN1412 (molde) CD28h + TGN1412 CTLA4h + TGN1412

  39. Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4 Comparación de CTLA-4 humano con CD28 humano CD28 humano – TGN1412 CTLA-4 humano – TGN1412

  40. Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4 Comparación de CTLA-4 humano con CD28 humano CD28 humano – TGN1412 CTLA-4 humano – TGN1412 I. hidrofóbicas I. hidrofóbicas

  41. Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4 Comparación de CTLA-4 humano con CD28 humano CTLA-4 humano – TGN1412 CD28 humano – TGN1412 cadena pesada cadena ligera

  42. Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4 Comparación de CTLA-4 humano con CTLA-4 macaco CTLA-4 humano CTLA-4 macaco ClustalW CTLA-4 humano – CTLA-4 macaco

  43. Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4 Comparación de CTLA-4 humano con CTLA-4 macaco CTLA-4 humano – TGN1412 • CTLA-4 macaco – TGN1412 CTLA4h + TGN1412 (molde) CD28h + TGN1412 (molde) CTLA4m + TGN1412 CTLA4h + TGN1412

  44. Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4 Comparación de CTLA-4 humano con CTLA-4 macaco CTLA-4 humano – TGN1412 • CTLA-4 macaco – TGN1412

  45. Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4 Comparación de CTLA-4 humano con CTLA-4 macaco CTLA-4 humano – TGN1412 • CTLA-4 macaco – TGN1412

  46. Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4 Comparación de CTLA-4 humano con CTLA-4 macaco CTLA-4 Humano – TGN1412 CTLA- 4- Macaco – TGN1412 Interacciones hidrofóbicas Interacciones hidrofóbicas

  47. Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4 Comparación de CTLA-4 humano con CTLA-4 macaco • CTLA4 macaco – TGN1412 CTLA4humano – TGN1412 cadena pesada cadena ligera

  48. HIPÓTESIS Diferentenivelde expresión CD28 Diferente CD28 Tormentacitoquinas Diferente CTLA-4 Homólogos remotos

  49. Hipótesis 4: Homólogosremotos ¿Se puede unir TGN1412 al factor IX de coagulación? MedianteModLink: búsqueda de homólogosremotos de TGN1412 Diana Y Diana Y TGN1412 Prot X Interleuquinas Interleuquinas TGN1412

  50. Hipótesis 4: Homólogosremotos ¿Se puede unir TGN1412 al factor IX de coagulación? 10C12 - Factor de coagulación IX humano BO2C11 – Factor VIII de Coagulaciónhumano

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