Metody určování struktury látek Chiroptické metody Obsah přednášek Základní pojmy, varianty metod

1. Metody určování struktury látek Chiroptické metody Obsah přednášek • Základní pojmy, varianty metod • Teoretické základy cirkulárního dichroismu, specifika instrumentace CD • Metodologie měření ECD a VCD, praktické poznámky, aplikace 4.-6. Aplikace chiroptických metod I a II, laboratoř ECD a VCD Chiroptické metody 2012

2. Modulace intenzity Vznik chiroptického signálu a funkce PEMu Modulace stavu polarizace faktor se získá kalibrací

3. Vznik chiroptického signálu a funkce PEMu Kalibrace pomocí pseudovzorku nabývajícího hodnoty v určitých bodech, jejich interpolací se získá kalibrační křivka: Kalibrace postihuje • experimentální faktor daného přístroje (koef. g) • PEM pracuje přesně na jedné vlnové délce, korigujeme dále účinnost vytváření přesného LCP a RCP záření je dáno vlnovou délkou,

4. Intenzitní (amplitudová) modulace s fFT (DC) 3.1 Metodologie měření VCD Komerčně dostupné spektrometry VCD - založené na FTIR spektrometru Schéma optické a elektronické části FTIR spektrometru amplitud. modulace s fPEM (AC)+ amplitud. modulace s fFT (DC) FTIR spektrometr Chiroptické metody 2011

5. 2.3 Metodologie měření VCD Schéma optické a elektronické části FTIR spektrometru amplitud. modulace fPEM (AC)+ amplitud. modulace fFT (DC) =IAC/IDC Chiroptické metody 2011

6. Celkové schéma FTIR spektrometru Chiroptické metody 2011

7. Experimentální podmínky ve spektroskopii VCD • Spektrální omezení • materiál speciálních optických elementů (PEM) • oborem citlivosti detektoru900-1800 cm-1:MCT, chlazený kapalným dusíkem 4000-6000 cm-1: InGaAs, pokojová teplota2000-4000 cm-1: MCT, termoelektricky chlazený, InSb chlazený kapalným dusíkem 5000-9000 cm-1: Ge, pokojová teplota • nejdostupnější oblast 2000 – 800 cm-1 • Dynamický rozsah A=0,1-1, optimální 0,4 - 0,6 • Dosahuje se kombinací vhodné koncentrace vzorku, tloušťky kyvety a vhodným rozpouštědlem • Typické koncentrace 0,05 – 1 mol l-1 typické objemy 50 – 100 ml typické hmotnosti 1 – 15 mg látky • Typický velký počet akumulací počet intergerogramů 104, doba - hodiny

8. Experimentální podmínky ve spektroskopii VCD Rozpouštědla pro měření VCD ve střední IR oblasti a příslušná „spektrální okna“ Chiroptické metody 2011

9. D2O vs. H2O ve střední IR

10. Korekce na nulovou linii ve spektroskopiích CD • Příčiny odchylek od nulové linie zkreslující výsledné exper. spektrum: • Dvojlom na optických materiálech čoček, filtrů, kyvet a dalších oken • Odrazy od povrchů • Vlastní absorpce vzorku • v oblasti absorpčního pásu dochází k anomální disperzi • velká absorpce způsobuje malou responzi detektoru, zvětšuje šum, zmenšuje S/N Tyto jevy spektrálně citlivé a způsobují falešné signály pozorované jako artifakty • Stálý požadavek ověřování reality CD signálů • Formulace a dodržování měřícího protokolu • Celé série měření provádět za stejných podmínek (rozbitá kyveta – zkreslení výsledků) Chiroptické metody 2011

11. Ukázka reálné nulové linie (-)-isoschizogamine Ondřej Julínek, 2006

12. Korekce na nulovou linii ve spektroskopiích CD Kvalitní spektrum, jsou-li dostupné enantiomery R a S při stejné koncentraci, pro jejich ideální spektra platí experim. CD obou enantiomerů obsahují stejnou spektrální distorzi : úpravou dostaneme z experimentálních spekter „spektrum šumu“, noise, (distorze + šum) a korigované spektrum jednoho enantiomeru: Optimální základní linie – spektrum racemátu o stejné absorpci jako vzorek Nejsou-li dostupné oba enantioméry ani racemát, použijeme ke korekci spektrum rozpouštědla

13. 3.2 Elektronový cirkulární dichroismus (ECD) lze sledovat ve viditelném oboru jen molekuly obsahující chromofory (barevné látky), nebo pak v UV oboru (UV chromofory) rozšířená technika využívaná v biochemii, nanotechnologiích (totologická chiralita), studium samoskladných systémů, chirálních ropoznávání

14. Schéma optické a elektronické části ECD spektrometru • Xenonová lampa • dvojitý hranolový monochromátor se současnou polarizační funkcí • polarizace vyladěna soustavou křemenných destiček („Filter“) • systém štěrbin • PEM: napětí vložené na PEM je optimaliváno tak, aby vznikala čtvtvlnná destička pro všechna l (neděje se tak ve VCD) • detektor je fotonásobič (photomultiplier, PM) • elektronika – zpětná vazba „feedback“ zajišťující konstantní DC signál (neděje se tak ve FT VCD) • zvyšování napětí na PM – úměrné absorbanci vzorku, měří se „absorpční spektrum“ • lze měřit jen do určitého napětí na PM

16. Metodologie měření ECD • 165 -1100 nm, nejčastěji 180 - 700 nm • disperzní spektrometry (scanning) obdobné jednopaprskovým absorpčním spektrofotometrům • optimalizované na velkou světelnou propustnost (throughput) • vybaveny polarizační optikou • disperzní funkce kombinovaná s polarizací (Brewsterův úhel) Praktické poznámky • nejdřív jednopaprskovou absorpci (podstatná je absorpce vzorek + rozpouštědlo), je-li A>2 => změna kombinace koncentrace, tloušťka kyvety, rozpouštědlo • Veškeré světlo musí procházet vzorkem, žádné reflexe na stěnách, kapalinovém menisku apod., pozor na „zúžené“ kyvety, nutno použit clonu a testovat

17. Praktické poznámky • Materiál kyvet s malým dvojlomem, izotropní • nulová línie, „baselina“ se získá jako ECD rozpouštědla, naprosto stejné podmínky jako pro měření vzorku, vždy odečíst baselinu • Měřit CD „kus“ před a za absorpčním pásem (20 nm), v oblasti bez absorpce by mělo být CD nulové, nebo aspoň rovné • Baselina obyčejně krátkodoubé (ms – min) fluktuace a dlouhodobé (min – h), lépe více akumulací, měřit „čerstvé“ nulové linie • V případě malých signálu se může stát, že CD není nulové vně absorpčních pásů, mělo by být alespoň rovné, jinak je něco špatně • Parametry měření: Časová konstanta (time constant) t (= doba, kdy přístroj „průměruje“ data rychlost záznamu (scan speed) s, šířka pásů (bandwidth) b Mělo by být: t . s <= b/2 S/N~(t . n . I0)1/2

18. Praktické poznámky • použití rychlých skenů pro nastavení citlivosti • použití rozpouštědel v tabulkách • kalibrace – 10-capmphorsulfuricacid

19. 3. Využití chiroptických spektroskopií 1. Detekce chirality a charakterizace enantiomerní čistoty, tzv enantiomerní přebytek – dostačuje optická rotace, lze nahradit cirkulárním dichroismem, zejména, nelze-li užít sodíkové čáry D 2. Chiroptické detektory při HPLC 3. Nejvýznamnější aplikace - strukturní informace o (chirálních) molekulách Alternativní metody (metody 1. volby): Strukturní metody s vysokým (atomovým) rozlišením: • difrakce X-záření, elektronová, neutronovádifrakce • NMR ve spojení s převodem na diastereomerní sloučeniny • numerické metody • skenovací a transmisní mikroskopie • stanovení absolutní konfigurace pomoci VCD, ECD ve spojení s přímým výpočtem a simulací spekter – pro rigidní molekuly, často farmaceutické aplikace nahrazují pracné určení pomocí rentgenové difrakce 19

20. Metody určování struktury látek Chiroptické metody Obsah přednášek • Základní pojmy, varianty metod • Teoretické základy cirkulárního dichroismu, specifika instrumentace CD • Metodologie měření ECD a VCD, praktické poznámky, aplikace 4.-6. Aplikace chiroptických metod I a II, laboratoř ECD a VCD Chiroptické metody 2012